RP-HPLC-DAD法初步考察5種化合物對(duì)照品的穩(wěn)定性

顧志榮，丁軍霞，王亞麗，孫宇靖

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000;2.甘肅中醫(yī)學(xué)院 當(dāng)歸研究所，甘肅 蘭州 730000)

阿魏酸、正丁基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯、正丁烯基苯酞以及亞油酸是中藥分析及植物成分分析中常見的5種化合物［1］。其中，正丁基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯以及正丁烯基苯酞屬內(nèi)酯類化合物，均為油狀，易通過氧化、水解、光解和異構(gòu)化等發(fā)生結(jié)構(gòu)改變［2］。這些化合物集中分布在傘形科植物中，特別在藁本屬(Ligusticum)植物中幾乎均含有，具有擴(kuò)血管、鎮(zhèn)痛、解痙、平喘及抗腫瘤等多重作用［3］。阿魏酸是重要的植物酚酸類成分，是植物細(xì)胞壁中與多糖和木質(zhì)素交聯(lián)的部分，是當(dāng)歸、川芎、阿魏、升麻等多種常用中藥的主要有效成分，具有抗氧化、清除自由基以及抗紫外線等作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、化妝品、農(nóng)藥和食品添加劑等方面［4］。但阿魏酸在水中穩(wěn)定性差，見光易分解，易與阿魏酸松柏酯相互轉(zhuǎn)化［5］。亞油酸是人體無法合成的必須脂肪酸，其不飽和鍵具有降低血清膽固醇的作用［6］，其鋁鹽廣泛用于制造油漆、涂料等，但其在空氣中易發(fā)生自氧化。由于這5種化合物常溫下在空氣中均不穩(wěn)定，因此給標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備及成分定性定量檢測(cè)帶來很大困難。

目前，對(duì)這5種化合物穩(wěn)定性的考察筆者未見報(bào)道，本研究采用RP-HPLC-DAD法研究5種對(duì)照品的甲醇混合溶液的穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

對(duì)照品阿魏酸(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)131187-100504);正丁基苯酞(批號(hào)342-12-11)及亞油酸(批號(hào)245-12-06)來自美國(guó)迪瑪公司;正丁烯基苯酞(批號(hào)2546-06-4)及Z-藁本內(nèi)酯(批號(hào)2456-03-2)為天津一方科技有限公司產(chǎn);甲醇，色譜純;超純水(自制，電阻率≥18.2 MΩ·cm)。

Agilent 1100 LC/DAD系統(tǒng)(G1312A二元梯度洗脫泵;G1315B DAD檢測(cè)器;Agilent化學(xué)工作站;G1313A進(jìn)樣器;G1316A柱溫箱);BT1250型電子天平;KQ-500DE超聲波清洗器。

1.2 供試品混合溶液的配制

分別精密稱取阿魏酸、正丁基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯、正丁烯基苯酞、亞油酸對(duì)照品適量，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為420，860，686，1 000，680 μg/mL 的混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得。

1.3 色譜條件

Waters X-Bridge C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動(dòng)相為甲醇(B)-水(A)，梯度洗脫條件見表1;體積流量0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):阿魏酸、正丁基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯及正丁烯基苯酞280 nm，亞油酸206 nm。柱溫30℃，進(jìn)樣體積10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

在1.3節(jié)色譜條件下，精密吸取混合供試品甲醇溶液10μL進(jìn)樣，色譜圖見圖1。

圖1 5種化合物的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of 5 chemical compounds

由圖1可知，阿魏酸、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯、亞油酸的保留時(shí)間分別為11.177，21.753，33.718，34.067 min 和 34.396 min，分離度均大于1.5，理論板數(shù)(按阿魏酸色譜峰計(jì)算)不低于5 000。

2.2 12 h內(nèi)穩(wěn)定性考察

精密吸取混合供試品甲醇溶液10μL，按1.3節(jié)色譜條件每隔2 h進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見表2和圖2。

表2 5種化合物12 h內(nèi)峰面積的變化Table2 Peak area change of 5 chemical compounds in 12 h

由圖2可知，5種化合物在甲醇溶液中于12 h內(nèi)均穩(wěn)定，但色譜圖的基線越來越不平穩(wěn)。由表2可知，5種化合物在甲醇溶液中于12 h內(nèi)色譜峰面積基本穩(wěn)定，RSD均小于2.0%。由此可知，5種對(duì)照品混合物的甲醇溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好，測(cè)試時(shí)不需新鮮配制。

圖2 5種化合物12 h內(nèi)的HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of 5 chemical compounds in 12 h

2.3 4 d內(nèi)穩(wěn)定性考察

精密吸取混合供試品甲醇溶液10μL，按1.3節(jié)色譜條件每天(白天測(cè)定)進(jìn)樣3次，每次間隔4 h，連續(xù)測(cè)定4 d(實(shí)驗(yàn)室溫度17.4 ～ 21.8℃，相對(duì)濕度55% ～64%)，結(jié)果見圖3和表3。

由圖4可知，5種化合物在甲醇溶液中于2 d內(nèi)及第3 d前8 h內(nèi)均穩(wěn)定，但色譜圖的基線隨放置時(shí)間的增加越來越不平穩(wěn)。從第3 d后4個(gè)小時(shí)開始，混合供試品開始出現(xiàn)分解，分解所得物質(zhì)的色譜峰分別為a、b及c，至第4 d全面分解，分解所得物質(zhì)的色譜峰為a～g?；衔锓纸夂蟮腍PLC圖譜雜峰較多，噪聲較大，基線不平穩(wěn)。

表3 5種化合物4 d內(nèi)峰面積的變化Table3 Peak area change of 5 chemical compounds in 4 d

由表3可知，正丁烯基苯酞和亞油酸4 d內(nèi)色譜峰面積基本穩(wěn)定，RSD均小于3.0%，而阿魏酸、正丁基苯酞以及Z-藁本內(nèi)酯4 d內(nèi)色譜峰面積的變化較大，RSD均大于6.0%，且峰面積呈減少趨勢(shì)，因此推測(cè)4 d內(nèi)分解的對(duì)照品可能為阿魏酸、正丁基苯酞以及Z-藁本內(nèi)酯，但分解的途徑及產(chǎn)物需要作進(jìn)一步研究。由上述分析可知，5種對(duì)照品混合物的甲醇溶液在2 d內(nèi)(亦可為56 h內(nèi))穩(wěn)定性較好，不需新鮮配制，超過56 h則需新鮮配制。

1，2，3 d表示當(dāng)日第2次進(jìn)樣所得圖譜;3 d(3)表示第3 d第3次進(jìn)樣所得圖譜;4 d(1)表示第4 d第1次進(jìn)樣所得圖譜。

圖3 5種化合物4 d內(nèi)的HPLC色譜圖Fig.3 HPLCchromatograms of 5 chemical compounds in 4 d

2.4 精密度考察

精密吸取混合供試品甲醇溶液10μL，按1.3節(jié)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果阿魏酸、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯以及亞油酸峰面積的RSD 分別為 0.81%，1.13%，1.39%，0.54%，1.90%;保留時(shí)間的 RSD 分別為 0.89%，0.93%，0.73%，1.05%，2.03%。結(jié)果表明，該儀器及方法日內(nèi)運(yùn)行精密度良好。

3 結(jié)論

(1)阿魏酸、正丁基苯酞、正丁烯基苯酞、Z-藁本內(nèi)酯以及亞油酸對(duì)照品混合物的甲醇溶液于56 h內(nèi)穩(wěn)定性較好，不需新鮮配制，超過56 h則需新鮮配制。

(2)對(duì)照品混合物從第3 d后4個(gè)小時(shí)開始出現(xiàn)分解，分解的對(duì)照品可能為阿魏酸、正丁基苯酞以及Z-藁本內(nèi)酯。

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