糜蛋白酶微生物限度檢查法的驗(yàn)證

王琪

摘 要 目的：對(duì)糜蛋白酶微生物限度檢查法進(jìn)行驗(yàn)證。方法：選用適宜的稀釋劑溶解糜蛋白酶作為供試液，分別用平皿法與薄膜過(guò)濾法對(duì)糜蛋白酶進(jìn)行微生物限度檢查法的驗(yàn)證。結(jié)果：兩種方法的回收率均≥70%。由于薄膜過(guò)濾法的取樣量是平皿法的10倍，故微生物的檢出率高于平皿法。結(jié)論：薄膜過(guò)濾法適用于糜蛋白酶微生物限度檢查。

關(guān)鍵詞 糜蛋白酶 微生物限度檢查法 回收率

中圖分類號(hào)：R927.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1006-1533（2014）19-0078-03

Validation of microbial limit test method for chymotrypsin

WANG Qi*

（Shanghai NO.1 Biochemical Pharmaceutical Co.， Ltd.， Shanghai 200240， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for microbial limit tests of chymotrypsin. Methods： An appropriate diluent was selected to dissolve chymotrypsin. The microbial limit were tested by both plate and film methods. Results： Microbial recoveries in two methods were≥70%， which showed that no inhibition of chymotrypsin to microbial growth. Microbial detection rate was higher in the film method than in the plate method since the sampling volume in the film method was 10 times larger than that in the plate method. Conclusion： The film method is suitable for the microbial limit test of chymotrypsin.

KEY WORDS chymotrypsin； microbial limit test； recovery

糜蛋白酶系自?；蜇i胰中提取的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質(zhì)。作用、用途與胰蛋白酶相似，但比胰蛋白酶分解能力強(qiáng)、毒性低、不良反應(yīng)小。可使黏稠的痰液稀化，便于咳出，對(duì)膿性和非膿性痰液均有效。臨床上常用于創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口愈合等。對(duì)糜蛋白酶進(jìn)行微生物限度檢查，能有效發(fā)現(xiàn)樣品中的微生物污染水平，從而進(jìn)行微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，保證用藥安全。

材料和方法

儀器

恒溫培養(yǎng)箱（Sanyo MIR253），電子天平（JY-5002型），高壓蒸汽滅菌鍋（新華XG1.D型、Sanyo MLS-3750），醫(yī)用電動(dòng)吸引器（YX940D），生物安全柜（Esco Class II BSC），電熱恒溫水浴鍋（HSY2-SP）。

藥品、培養(yǎng)基和試劑

糜蛋白酶原料藥（白色或類白色結(jié)晶性粉末或無(wú)定型粉末，上海第一生化藥業(yè)有限公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：111222）和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：110809）購(gòu)自上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（批號(hào)：1109262）和改良馬丁培養(yǎng)基（批號(hào)：111121）購(gòu)自北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司；0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液；pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。培養(yǎng)基在使用前按廠方說(shuō)明書要求高壓滅菌，試劑在使用前于121 ℃滅菌30 min。

菌種與菌液制備

細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株為：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B）26003，大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B）44102，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B）63501；霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株為：白色假絲酵母（Candida albicans） CMCC（F）98001，黑曲霉（Aspergillus niger）CMCC（F）98003。以上菌種均由上海市食品藥品檢驗(yàn)所提供。參照中國(guó)藥典方法培養(yǎng)菌種，制備菌懸液或孢子懸液[1]。

驗(yàn)證方法

供試液的制備

共取3個(gè)不同批號(hào)產(chǎn)品對(duì)微生物限度檢查方法進(jìn)行平行試驗(yàn)。

取供試品10 g加入到100 ml pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中[1]附錄104，混勻后，作為1∶10供試液。

平皿法

取供試液1 ml，分別加入上述5種50～100 CFU/ml的試驗(yàn)菌株1 ml，分別傾注15～20 ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，按文獻(xiàn)[1-2]規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)作為試驗(yàn)組；同法測(cè)定相應(yīng)加入的試驗(yàn)菌菌落數(shù)，作為菌液組；測(cè)定供試液本底菌菌落數(shù)，作為供試液對(duì)照組。培養(yǎng)后對(duì)菌落計(jì)數(shù)?；厥章剩?）=[（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試液對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)]×100%）[2-3]。

薄膜過(guò)濾法

取供試液10 ml，微孔濾膜（混合纖維素酯膜，孔徑0.45 mm，直徑50 mm，上海半島實(shí)業(yè)有限公司）過(guò)濾，用pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液50 ml沖洗玻璃壁上殘留的供試液，分別加入上述5種50～100 CFU/ml的試驗(yàn)菌1 ml，抽濾，取膜，貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，按中國(guó)藥典2010版規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)[1-2，5]，平行制備2個(gè)平皿。培養(yǎng)后對(duì)菌落計(jì)數(shù)，并計(jì)算回收率。

結(jié)果

平皿法檢測(cè)

平皿法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，采用平皿法進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，5種試驗(yàn)菌的回收率為97.2%～103.2%，均大于藥典規(guī)定（70%），表明糜蛋白酶對(duì)其無(wú)抑制作用。但由于3批糜蛋白酶采用平皿法檢驗(yàn)時(shí)均未檢出微生物，考慮到供試液取樣量的多少可能影響微生物的檢出率[4]，所以擴(kuò)大取樣量，采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行驗(yàn)證。

薄膜過(guò)濾法檢測(cè)

薄膜過(guò)濾法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

試驗(yàn)結(jié)果表明，同樣3批糜蛋白酶分別采用平皿法和薄膜過(guò)濾法進(jìn)行方法驗(yàn)證，試驗(yàn)組的細(xì)菌回收率為92.1%～108.4%，但由于取樣量的不同，本底樣品的微生物檢出率有明顯的差異。采用平皿法時(shí)，3批糜蛋白酶均未檢出微生物，但采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，3批糜蛋白酶均有一定量的微生物生長(zhǎng)[6-7]。

樣品測(cè)定

采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的薄膜過(guò)濾法對(duì)5批糜蛋白酶進(jìn)行微生物限度檢查，結(jié)果見(jiàn)表3。

討論

對(duì)糜蛋白酶進(jìn)行微生物限度檢查法的驗(yàn)證，有助于對(duì)其原料藥進(jìn)行微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。由試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種檢測(cè)方法中糜蛋白酶均無(wú)抑菌作用。

兩種方法的檢測(cè)結(jié)果表明薄膜過(guò)濾法的微生物檢出率明顯高于平皿法，其原因是兩種方法的取樣體積不同（平皿法1 ml，薄膜過(guò)濾法10 ml）?？紤]到微生物在糜蛋白酶樣品中可能是不均勻分布的，故采用薄膜過(guò)濾法能較為準(zhǔn)確、有效地反映出糜蛋白酶樣品中污染的微生物數(shù)。

之所以對(duì)糜蛋白酶樣品進(jìn)行微生物限度檢查，主要考慮到原料藥也是導(dǎo)致微生物污染的主要途徑之一。要滿足成品的微生物污染控制，還需要結(jié)合更多生產(chǎn)過(guò)程的控制來(lái)進(jìn)一步保證產(chǎn)品的質(zhì)量。

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（收稿日期：2014-06-06）