門靜脈高壓癥小動物模型的構(gòu)建及研究進展

王維杰+嚴佶祺+李宏為

摘 要 門靜脈高壓癥是肝硬化最常見且致命的并發(fā)癥，建立動物模型是研究門靜脈高壓癥的理論基礎(chǔ)。本文綜述門靜脈高壓癥小動物模型的構(gòu)建方法及各種模型的特點和研究進展，以在研究中可根據(jù)不同目的選用恰當?shù)膭游锬Ｐ汀?/p>

關(guān)鍵詞 門靜脈高壓癥 肝硬化 動物模型

中圖分類號：R657.3+4 文獻標識碼：C 文章編號：1006-1533（2014）18-0003-05

Establishment of small animal models for portal hypertension and its research progress

WANG Weijie1，2， YAN Jiqi1， LI Hongwei1

（1.Department of Surgery， Ruijin Hospital， School of Medicine， Shanghai Jiao Tong University， Shanghai 200025， China； 2. Department of Surgery， the First Affiliated Hospital， School of Medicine， Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China）

ABSTRACT Portal hypertension （PHT） is the most common and fatal complication of cirrhosis. Animal model is the theoretical basis in PHT research. This paper reviews the common methods used in the establishment of PHT small animal models， as well as their characteristics and research progress. The appropriate animal models can be selected according to different purposes of study.

KEY WORDS portal hypertension； liver cirrhosis； animal model

我國是慢性肝炎和肝硬化的高發(fā)地區(qū)，約有10%的人群為乙型肝炎病毒（HBV）攜帶者，每年因肝硬化死亡的人數(shù)高達數(shù)十萬。門靜脈高壓癥（portal hypertension， PHT）是肝硬化最常見且致命的并發(fā)癥[1- 2]。構(gòu)建穩(wěn)定、可重復(fù)性強、操作簡單和模擬性好的動物模型，是研究PHT入肝血流阻力增加、側(cè)支循環(huán)建立與開放、內(nèi)臟系統(tǒng)血流高動力循環(huán)等病理生理的重要手段[3- 4]。因此，本文綜述研究面廣、應(yīng)用性強的小動物PHT模型的構(gòu)建及研究進展。

肝前型PHT

部分門靜脈結(jié)扎（partial portal vein ligation， PPVL）模型已廣泛應(yīng)用于PHT病理生理學(xué)機制的研究[5- 6]，原理是通過縮窄門靜脈主干，使門靜脈血液回流受阻從而導(dǎo)致門靜脈壓力升高，但肝臟組織學(xué)幾乎正常[7]。通常是把1個20號鈍頭直針（直徑0.889 mm）縱向置于大鼠門靜脈主干旁，用3-0絲線將門靜脈和直針結(jié)扎后抽出直針，使門靜脈主干直徑僅為0.889 mm，而小鼠通常選用27號鈍頭直針和5-0的絲線結(jié)扎，造成門靜脈一定程度狹窄，從而建立PHT模型[8- 9]。

PPVL模型操作簡單、廉價、重復(fù)性好、門靜脈高壓形成迅速且持續(xù)穩(wěn)定。通常術(shù)后2 d門靜脈側(cè)支可檢出分流，術(shù)后4 d腸系膜血管開始明顯擴張，心輸出量也顯著增加[4]，術(shù)后1周，大鼠PHT已完全形成，包括顯著的血流高動力循環(huán)和門靜脈側(cè)支分流[7- 8]。之后，隨著側(cè)支循環(huán)的開放，門靜脈壓力會有所下降，但PHT可穩(wěn)定地維持至術(shù)后3周以上[5]。該模型主要適用于門靜脈系統(tǒng)高動力循環(huán)狀態(tài)和側(cè)支循環(huán)形成機制的研究，以及前向性學(xué)說的探討[10-11]（表1）。

肝內(nèi)型PHT模型

膽總管結(jié)扎離斷（common bile duct ligation， CBDL）

CBDL模型是一種繼發(fā)性膽汁性肝硬化PHT [12]，原理是手術(shù)使肝外膽總管梗阻，從而引起梗阻部位以上膽管擴張、膽汁淤積及膽道內(nèi)壓力增高，甚至可引發(fā)肝內(nèi)小膽管擴張破裂。擴張膽管及膽汁外滲壓迫肝內(nèi)血管，導(dǎo)致肝內(nèi)血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的扭曲和變形，使肝細胞缺血和壞死，纖維組織增生向膽管伸展，包繞肝小葉，增加肝內(nèi)阻力和門靜脈血流量，最終形成肝硬化PHT[13-14]。具體方法是分離膽總管，在盡量靠近肝左、右膽管匯合處和胰管入口雙道結(jié)扎膽總管，然后切除兩結(jié)扎點之間膽總管，以避免膽管再通[15]。

CBDL模型門靜脈壓力升高顯著，并可出現(xiàn)廣泛的門體分流。由于大鼠無膽囊，因此PHT形成相對迅速且穩(wěn)定。而小鼠耐受性差，往往因膽囊急劇擴大，甚至穿孔而死亡率增加[4]。大鼠在CBDL術(shù)后2周即表現(xiàn)輕微的門靜脈高壓，術(shù)后3周門靜脈壓力已顯著而穩(wěn)定地升高，肝內(nèi)主要以膽管內(nèi)皮細胞、肝星狀細胞增殖和炎性滲出為主[16]。而術(shù)后4～6周膽汁性肝硬化PHT可穩(wěn)定形成，表現(xiàn)為嚴重的高門靜脈壓力、血流高動力循環(huán)和30%～60%的門體分流，通常約60%的大鼠可形成腹水[4]。而相對小鼠而言，CBDL術(shù)后2～3 d為急性肝細胞損傷的高峰期，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)中性粒細胞大量滲出，促增殖基因上調(diào)，膽汁梗阻和血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶達高峰。術(shù)后5 d，肝細胞增殖修復(fù)反應(yīng)出現(xiàn)高峰。術(shù)后2～3 d，大膽管出現(xiàn)膽管內(nèi)皮細胞增殖，而小膽管內(nèi)皮細胞增殖則出現(xiàn)于術(shù)后5 d。術(shù)后14 d肝內(nèi)主要為淋巴細胞和Kupffer細胞浸潤，表現(xiàn)為慢性炎癥和纖維化修復(fù)反應(yīng)，間質(zhì)內(nèi)累積合成大量膠原蛋白[17]。

CBDL模型與人類肝硬化患者在門靜脈及全身血流動力學(xué)方面有較好的相似性，適合肝硬化PHT病理生理學(xué)機制的研究，也是探索藥物治療作用的有效模型[18-20]，但是存在以下缺陷：①存留的膽總管易形成膽管囊腫，壓迫門靜脈主干，而結(jié)扎前膽管內(nèi)注射4%的甲醛溶液可解決此問題；②術(shù)后5周死亡率高達20%，但是術(shù)前預(yù)防性給予抗生素（青霉素100 mg/kg）和術(shù)后每周1次注射維生素K（50 μg）可有效降低死亡率；③不適合膽汁代謝藥物的研究；④術(shù)后腹腔黏連，不利于下一步外科手術(shù)操作，膽管解剖變異導(dǎo)致建模失敗[4]。

四氯化碳（carbon tetrachloride， CCl4）誘導(dǎo)肝硬化PHT模型

CCl4是肝硬化誘導(dǎo)最常用的化學(xué)物質(zhì)，具有量效關(guān)系，其作用原理是CCl4進入機體后，經(jīng)肝細胞微粒體細胞色素P450激活生成活性三氯甲基（CCl3），CCl3再通過攻擊肝細胞膜的磷脂引起脂質(zhì)過氧化從而破壞膜性結(jié)構(gòu)，并可與蛋白質(zhì)共價結(jié)合，損害線粒體導(dǎo)致肝內(nèi)還原性輔酶A（NADH）和三磷酸腺苷（ATP）生成減少，進而抑制脂肪酸氧化和三羧酸循環(huán)，導(dǎo)致小葉中央肝細胞壞死。此外，由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受損可導(dǎo)致脂蛋白合成障礙，使三酰甘油和脂肪酸在肝細胞內(nèi)蓄積，形成脂肪變性。病變部位募集的巨噬細胞和各種炎性細胞清除壞死區(qū)域，并激活纖維化修復(fù)反應(yīng)，增加細胞外間質(zhì)合成，最終由增生的實質(zhì)和間葉細胞取代壞死的肝細胞團。因此，低濃度的CCl4反復(fù)應(yīng)用，可使肝組織受到損害-修復(fù)-損害的循環(huán)破壞作用，最終導(dǎo)致肝硬化PHT [3， 14]。

CCl4誘導(dǎo)的有效途徑包括腹腔注射、口服灌胃和霧化吸入，通常多采用30%～60%CCl4橄欖油劑，造模時間依給藥途徑和劑量而不同。對于傳統(tǒng)皮下注射法，CCl4易被機體吸收進入循環(huán)系統(tǒng)，對腦、腎毒性較大，注射位置易發(fā)生浸潤性膿腫和潰瘍，死亡率高達30%～40%，且肝硬化形成率較低，因此不推薦此方式[4]。CCl4腹腔內(nèi)注射時，經(jīng)門靜脈系統(tǒng)吸收的濃度高，肝硬化形成時間短，但死亡率為20%～35%。CC14 灌胃的吸收和代謝途徑類似于腹腔注射，經(jīng)門靜脈系統(tǒng)進入肝實質(zhì)，但操作相對復(fù)雜，腸道反應(yīng)較大。用中小劑量（1.6 g/kg）CCl4制備小鼠肝硬化時，灌胃誘導(dǎo)的速度優(yōu)于腹腔注射，且兩者生存率無差異[21]。CC14霧化吸入時，2～4周即可見顯著的纖維化，5～7周后可見嚴重的纖維間隔形成，8～9周后即可形成肝硬化，但該法對呼吸道刺激大，動物不易耐受，中樞毒性較大，易污染環(huán)境和傷害實驗人員[22]。

此外，CC14 與苯巴比妥聯(lián)合誘導(dǎo)的方法也很常用，其機制為苯巴比妥誘導(dǎo)肝內(nèi)混合功能氧化酶，增加細胞色素P450活性，加速CCl4向CC13轉(zhuǎn)化。在CCl4給藥前1周，大鼠飲用水中加入苯巴比妥（300 mg/L），12～15周后即可形成小結(jié)節(jié)性肝硬化，呈現(xiàn)典型PHT、30%～60%的門體分流和血流高動力循環(huán)，且多數(shù)大鼠在12～20周可形成腹水。這種方法可明顯縮短建模時間，8～10周便可形成肝硬化，但由于大鼠的敏感性不同，實驗中很難保證同一批模型的均質(zhì)性，且死亡率可增至40%，而根據(jù)動物體重變化及耐受情況調(diào)整CCl4劑量，能有效地降低大鼠死亡率[4]。

總之，CC14模型在形態(tài)學(xué)、病理生理學(xué)的某些方面與人類肝硬化類似，兩者均有肝細胞壞死后的再生，晚期的纖維浸潤幾乎不可逆，適于肝硬化PHT腹水和側(cè)支循環(huán)形成機制的研究[23- 24]。

硫代乙酰胺（thioacetamide， TAA）和二甲基亞硝胺（dimethylnitrosamine， DMNA）誘導(dǎo)肝硬化PHT模型

長期低劑量應(yīng)用某些致癌物如TAA和DMNA等可誘導(dǎo)動物肝硬化PHT和肝癌的發(fā)生[14]。TAA是一種選擇性肝細胞毒素，能夠穩(wěn)定地誘導(dǎo)化學(xué)毒性肝硬化和膽管癌模型。TAA進入機體后首先由肝細胞微粒體單加氧酶、還原型輔酶Ⅱ（NADPH）及細胞色素P450作用下轉(zhuǎn)化成乙酰胺及TAA-S-oxide，后者進而轉(zhuǎn)化為兩種不穩(wěn)定的活性代謝物產(chǎn)物TAA-S和S-dioxide，它們通過共價結(jié)合大分子導(dǎo)致肝細胞變性、壞死。通常TAA首先作用于靜脈周圍和匯管區(qū)，短期的大劑量應(yīng)用可導(dǎo)致肝小葉中心急性壞死。長期慢性作用可促使膽管增生和肝硬化發(fā)生，且在組織學(xué)上與病毒誘發(fā)的肝硬化很相似。反復(fù)應(yīng)用TAA，激活肝內(nèi)纖維化修復(fù)和炎性反應(yīng)，最終誘發(fā)肝硬化PHT [3， 14]。

TAA主要以大結(jié)節(jié)性肝硬化為主，通常采取口服TAA飲用水和腹腔注射途徑，且后者更穩(wěn)定。通常在12周時出現(xiàn)PHT，典型的血流高動力循環(huán)出現(xiàn)在12周之后，約40%的大鼠可形成腹水，而18周后多可形成膽管癌。不同于CCl4，TAA誘導(dǎo)的肝硬化狀態(tài)穩(wěn)定，停藥短期不表現(xiàn)自然恢復(fù)效應(yīng)[3-4]。

DMNA是另一種具有肝毒性、細胞毒性和免疫毒性的化學(xué)物質(zhì)，主要在肝微粒體藥物氧化酶系統(tǒng)進行氧化代謝，活性代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致體內(nèi)核苷酸、氨基酸殘基等重要的生命物質(zhì)發(fā)生甲基化，從而促進肝細胞壞死，細胞外基質(zhì)進行性增加，最終誘發(fā)肝纖維化和肝硬化發(fā)生。DMNA通常以腹腔注射途徑給藥，在連續(xù)給藥5周后大鼠可出現(xiàn)肝纖維化和門靜脈高壓，但形成典型的肝硬化和腹水多需誘導(dǎo)13周以上[4]。

PHT模型的選擇（表2）

肝內(nèi)阻力不斷增加和內(nèi)臟血流高動力循環(huán)是肝硬化PHT形成的主要病理生理機制，而肝血竇內(nèi)皮細胞功能異常和組織結(jié)構(gòu)進行性紊亂是肝內(nèi)阻力增加的主導(dǎo)因素[1]。在肝硬化PHT肝內(nèi)血管緊張性增加和血管反應(yīng)性失衡等機制的研究中，CCl4模型應(yīng)用最多，研究證實肝血竇內(nèi)皮功能紊亂導(dǎo)致NO產(chǎn)生不足和血管收縮性物質(zhì)合成增加是肝內(nèi)血管反應(yīng)性異常的主要原因。此外，CBDL和TAA模型也可用于肝內(nèi)血管反應(yīng)性異常的研究，但不如CCl4模型穩(wěn)定一致[4]。

內(nèi)臟小動脈血管舒張是血流高動力循環(huán)演進中典型的病理生理特征，其原因是肝外NO為主的舒血管物質(zhì)合成增加和內(nèi)臟小血管對內(nèi)源性收縮物質(zhì)的高反應(yīng)性[23]。PPVL、CBDL、CCl4和TAA/DMNA模型均可用于血流高動力和側(cè)支循環(huán)形成病理機制的研究。與肝內(nèi)型PHT相比，PPVL模型制備穩(wěn)定、便捷，且肝外分流近100%，而前者一般不會超過60%。因此，對于PHT系統(tǒng)、腸系膜和側(cè)支循環(huán)異常的研究，PPVL模型的有效性展現(xiàn)了更大的優(yōu)勢，非常適于理論假設(shè)的初步探索，而后期采用肝硬化PHT模型進一步的驗證也很有必要[4]。

傳統(tǒng)觀念認為PHT腸系膜原有血管通道的再通增加了腸系膜血流循環(huán)，而新近研究表明腸系膜血管新生在內(nèi)臟血流高動力和側(cè)支循環(huán)形成中同樣有著至關(guān)重要的作用，PPVL、CBDL和CCl4模型多見于此方向的研究[6， 19， 23]。此外，有關(guān)肝硬化腹水產(chǎn)生病理機制的研究，CCl4模型應(yīng)用最多，也有少數(shù)學(xué)者采用CBDL模型[4]。

綜上所述，動物模型是實驗研究的基礎(chǔ)，不同類型的PHT形成的主要病理機制大相徑庭，因此，穩(wěn)定地建立多種PHT動物模型，有針對性的選擇適合研究方向的模型，更有利于揭示PHT演進中確切的病理機制，為其靶向治療提供有價值的實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2014-07-05）