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    絲裂霉素在兔離體角膜中的滲透特性研究

    2014-10-16 03:16:50王石健應(yīng)苗法
    實用藥物與臨床 2014年6期
    關(guān)鍵詞:眼用絲裂霉素離體

    王石健,應(yīng)苗法

    0 引言

    絲裂霉素是頭狀鏈霉菌中分離得到的一種毒副作用少的抗代謝成分,具有苯醌、烏拉坦和乙烯亞胺3種有效基團,在機體內(nèi)絲裂霉素中的苯酯還原成為雙功能烷化基團,可使互補的DNA雙鍵之間產(chǎn)生交叉連接,選擇性抑制RNA合成,抑制增殖期DNA復(fù)制,對增殖各期細(xì)胞和靜止期細(xì)胞均有抑制作用[1]。臨床用于治療消化道癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌等多種腫瘤。絲裂霉素亦可抑制成纖維細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移,并阻止成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原物質(zhì),同時可阻止血管的再生,其抗瘢痕效果優(yōu)于其他抗代謝藥,在眼科領(lǐng)域使用廣泛[2-3]。但是絲裂霉素在眼部的應(yīng)用也伴隨著較少見而嚴(yán)重的不良反應(yīng)[4],主要有角膜水腫、角膜穿孔、眼部感染、鞏膜鈣化、鞏膜軟化、鞏膜潰瘍、虹膜炎、繼發(fā)性青光眼等。另外,絲裂霉素的穩(wěn)定性比較差,也限制了其應(yīng)用的進(jìn)一步推廣。為了克服現(xiàn)有絲裂霉素給藥系統(tǒng)的缺點,新型的絲裂霉素眼用給藥系統(tǒng)也在不斷的開發(fā)中[5-8],包括新型滴眼劑、眼用膜劑、眼用溫敏凝膠、可降解植入劑等。藥物在角膜中的滲透特性對給藥后藥物在眼部的分布、作用與消除均有重要的影響,是眼部給藥系統(tǒng)設(shè)計時需要重點考慮的因素。本研究采用兔角膜為模型,使用水平式擴散儀考察了絲裂霉素在離體角膜中的滲透特性,為絲裂霉素新型眼用給藥系統(tǒng)的開發(fā)提供參考。

    1 方法

    1.1 儀器和試劑

    1.1.1 儀器 高效液相色譜儀,配備G1310A泵,G1314A紫外檢測器,7255i手動進(jìn)樣器,TC100柱溫箱(Agilient 1100,美國),水平式擴散池(AH-6,上海鍇凱科技有限公司,接受室與供應(yīng)室體積均為4 mL),分析天平(AL204,梅特勒-托利多公司)。

    1.1.2 試劑 絲裂霉素對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:130438-200502),絲裂霉素注射液(浙江海正藥業(yè),規(guī)格10 mg,批號:120401),谷胱甘肽氧化型(上海生工生物工程有限公司),甲醇為色譜純(德國默克),其余試劑均為分析純。

    1.1.3 實驗動物 新西蘭兔(雄性,2 kg左右,浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)

    1.2 色譜條件 色譜柱:Agilent Zorbax C18柱(150 mm × 4.6 mm,5 μm),流動相:甲醇∶水 =70∶30,v/v,流速:1 mL/min,檢測波長:365 nm,柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

    1.3 溶液制備 谷胱甘肽緩沖液的配制[9]:A液:氯化鈉12.4 g,氯化鉀0.716 g,磷酸二氫鈉0.206 g,碳酸氫鈉4.908 g,用水溶解并定容至1L;B液:谷胱甘肽氧化型0.184 g,氯化鈣0.23 g,氯化鎂0.318 g,葡萄糖1.8 g,用水溶解并定容至1 L。分別置4℃保存,臨用前混合。

    精密稱取絲裂霉素對照品約10 mg,用甲醇溶解并定容至25 mL,即得絲裂霉素的對照品貯備液。將對照品貯備液適當(dāng)稀釋即得絲裂霉素的對照品溶液。

    1.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 分別取空白接受液、絲裂霉素對照品溶液和樣品溶液20 μL進(jìn)樣,記錄色譜圖,考察釋放介質(zhì)及其他角膜浸出物質(zhì)對絲裂霉素的測定有無干擾。

    1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 用甲醇將絲裂霉素貯備液稀釋成濃度為 0.2、1、2、5、10、20 μg/mL 的溶液,分別進(jìn)樣,記錄峰面積。以峰面積(C)對濃度(C)進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.6 回收率 分別取絲裂霉素貯備液適量,用空白接收液稀釋成濃度為1、5、10 μg/mL的溶液,HPLC測定,計算回收率。

    1.7 精密度與穩(wěn)定性 分別取用空白接收液稀釋成濃度為 1、5、10 μg/mL 的絲裂霉素溶液,HPLC連續(xù)測定6次,記錄絲裂霉素的峰面積,計算RSD,考察精密度;取濃度為5 μg/mL的絲裂霉素溶液在溫室下12 h內(nèi)不同時間HPLC測定,記錄絲裂霉素的峰面積,計算RSD,考察穩(wěn)定性。

    1.8 離體角膜滲透實驗

    1.8.1 離體角膜的制備 新西蘭兔耳緣靜脈注射空氣處死后,立即使用眼科鑷和手術(shù)刀分離角膜,除去鞏膜、虹膜、睫狀體等組織,置于4℃谷胱甘肽緩沖液中備用。

    1.8.2 角膜滲透試驗 取新鮮制備的離體角膜,置于水平式擴散池的供應(yīng)室和接收室之間,角膜外側(cè)面朝向供應(yīng)室。在接受室內(nèi)加入4 mL谷胱甘肽緩沖液作為接收液,供應(yīng)室內(nèi)加入0.02%絲裂霉素溶液4 mL,水浴溫度設(shè)置34℃,磁力攪拌速度為 250 r/min。分別在試驗開始后 1、2、3、4、6 h取樣1 mL,并補充等量同溫的新鮮接收液。樣品經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,取續(xù)濾液HPLC測定峰面積,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度,計算累積透過量。以累積透過量對時間作圖,即得絲裂霉素在離體角膜的滲透曲線。

    1.8.3 滲透特性分析 將所得絲裂霉素的滲透曲線按照不同的動力學(xué)方程進(jìn)行擬合,考察其滲透特性。

    2 結(jié)果

    2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性 絲裂霉素的系統(tǒng)適應(yīng)性實驗結(jié)果如圖1所示。HPLC測試時間約17 min,絲裂霉素的保留時間約12.5 min,峰形良好,在絲裂霉素的保留時間處無其他雜質(zhì)干擾測定。

    圖1 絲裂霉素的高效液相色譜圖

    2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以絲裂霉素的峰面積A對濃度C作線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線:A=28.081C+0.719,r=0.999 9,結(jié)果顯示,絲裂霉素在 0.2~20 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,滿足測試要求。

    2.3 回收率 絲裂霉素回收率的結(jié)果如表1所示,結(jié)果顯示,絲裂霉素在高中低各濃度的回收率良好,平均回收率為99.70%,符合測定要求。

    2.4 精密度與穩(wěn)定性 低中高濃度絲裂霉素精密度試驗 RSD分別為 0.62%、0.22%、0.14%(n=6)。結(jié)果顯示絲裂霉素在各濃度下精密度良好。濃度為5 μg/mL的絲裂霉素在溫室下放置,分別于1、2、4、6、8、12 h 測定,RSD 為 0.89%。結(jié)果顯示絲裂霉素在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.5 角膜滲透試驗 絲裂霉素在離體角膜中的滲透性能如圖2所示。

    表1 絲裂霉素的回收率

    圖2 絲裂霉素經(jīng)過角膜的滲透曲線(n=6)

    2.6 分析 將絲裂霉素經(jīng)過角膜的滲透曲線按照不同的動力學(xué)方程進(jìn)行擬合,結(jié)果如表2所示。其中,按照一級動力學(xué)方程擬合所獲得的相關(guān)系數(shù)r值最高,故認(rèn)為絲裂霉素在角膜的滲透符合一級動力學(xué)方程。

    表2 絲裂霉素滲透特性的擬合結(jié)果(n=6)

    3 討論

    絲裂霉素紫外吸收較高,一般常采用HPLCUV測定,即可達(dá)到精密度和檢測限的要求。有文獻(xiàn)報道使用梯度洗脫法[9]、緩沖鹽溶液作為流動相[10]測定絲裂霉素,操作比較復(fù)雜、實驗條件要求較高。有報道稱使用甲醇和水作為流動相效果良好[11]。本研究采用甲醇∶水(70∶30,v/v)作為流動相,操作簡便,而且絲裂霉素在此流動相下保留時間適中,峰形對稱,且無雜質(zhì)干擾,故使用此流動相進(jìn)行分析。絲裂霉素在水中穩(wěn)定性差,降解較快[12],故本實驗的樣品在取樣后立即進(jìn)行測定。穩(wěn)定性試驗的結(jié)果顯示絲裂霉素在12 h內(nèi)是穩(wěn)定的,滿足測試的要求。

    考察藥物在離體角膜中的滲透性能,通常采用透皮擴散池進(jìn)行試驗。對于凝膠等半固體眼用制劑,通常采用直立式擴散池進(jìn)行考察[13-14]。但是對于藥物溶液,若使用直立式擴散池,由于角膜表面的液體流動較慢,形成濃度較低的液層,會降低藥物的透角膜速度,故考察藥物溶液的角膜滲透特性時常采用水平式擴散池[15]。本研究因此采用水平式擴散池考察絲裂霉素的透角膜特性。

    在離體角膜的滲透性研究中,通常采用谷胱甘肽緩沖液作為接收液的主要成分[16],因為角膜在此緩沖液中可維持活性長達(dá)6 h[17]。接受液不僅需要能夠維持角膜的活性,還需要有容納藥物的能力。為了保持在滲透試驗過程中的漏槽條件,通常需要加入乙醇等物質(zhì)增加藥物在接受液中的溶解度[19]。由于絲裂霉素的水溶解性良好,在本實驗中,單獨使用谷胱甘肽緩沖液即可滿足漏槽條件。

    對于絲裂霉素在離體角膜中的滲透特性的方程擬合,評價標(biāo)準(zhǔn)是擬合方程的回歸系數(shù)?;貧w系數(shù)越大,說明擬合優(yōu)度越好,絲裂霉素越可能是按照此種方式透過角膜。本研究采用了三種藥物透過介質(zhì)常見的模型進(jìn)行擬合,結(jié)果顯示絲裂霉素經(jīng)角膜的滲透過程符合一級動力學(xué)方程,說明絲裂霉素在角膜的滲透具有一定的時滯,但隨著時間的延長,絲裂霉素的滲透速率逐漸增加。這提示我們在設(shè)計靶部位在眼內(nèi)的給藥系統(tǒng)時,應(yīng)設(shè)法延長絲裂霉素在淚液中的滯留時間;反之,設(shè)計作用于眼表的給藥系統(tǒng)時,則應(yīng)縮短絲裂霉素在淚液中的滯留時間,以免藥物進(jìn)入眼內(nèi)引起副作用。

    由于制劑給藥于眼部后的實際情況比較復(fù)雜,影響因素較多,例如結(jié)膜囊容量有限、淚液引流引起制劑流失或稀釋等,離體角膜的滲透試驗不能完全說明絲裂霉素在體內(nèi)經(jīng)角膜滲透的真實情況。

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