糖皮質(zhì)激素對(duì)內(nèi)毒素耐受的影響

張麗麗，趙欣欣，楊 琦，閔 睿，王宗謙

0 引言

內(nèi)毒素又名脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，是革蘭陰性菌菌壁的主要成分，具有廣泛的生物學(xué)活性，可通過(guò)激活相關(guān)受體介導(dǎo)信號(hào)通路調(diào)控炎癥及免疫系統(tǒng)。當(dāng)機(jī)體受到內(nèi)毒素打擊時(shí)，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞(主要為單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng))活化并產(chǎn)生多種促炎因子，如腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-a，TNF-α)、白細(xì)胞介素 1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-8、干擾素 γ 等，以及多種抗炎介質(zhì)，如 IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(transforming growth factor β，TGF-β)、糖皮質(zhì)激素(glucocorti-coid，GC)等，參與機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)，使機(jī)體出現(xiàn)如發(fā)熱、體重下降，嚴(yán)重時(shí)可致膿毒癥、系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，甚至多器官功能障礙綜合征等。然而，預(yù)先予機(jī)體小劑量的LPS刺激，機(jī)體對(duì)隨后大劑量或致死量LPS攻擊呈現(xiàn)出低反應(yīng)甚至無(wú)反應(yīng)的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為內(nèi)毒素耐受。內(nèi)毒素耐受的形成避免了機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，對(duì)機(jī)體是一種保護(hù)作用。內(nèi)毒素耐受的發(fā)生機(jī)制目前尚未完全清楚。LPS通過(guò)引起內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素釋放，抑制促炎因子基因轉(zhuǎn)錄［1-2］。糖皮質(zhì)激素可能參與內(nèi)毒素耐受的發(fā)生機(jī)制。然而，糖皮質(zhì)激素對(duì)內(nèi)毒素耐受的形成起到促進(jìn)還是抑制作用，目前不同的研究結(jié)論不同。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)不同時(shí)間點(diǎn)給予外源性糖皮質(zhì)激素-地塞米松干預(yù)，觀察其對(duì)內(nèi)毒素耐受的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～12周齡雌性昆明鼠，體重26～38 g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院動(dòng)物室獨(dú)立通風(fēng)籠具系統(tǒng)，標(biāo)準(zhǔn)滅菌復(fù)合飼料及純凈水飼養(yǎng)，室內(nèi)自然溫度及光照。主要試劑:脂多糖(LPS，O55:B5)(寶信生物公司)，地塞米松磷酸鈉注射液(天津藥業(yè)焦作有限公司)，TNF-α ELISA kit(博士德)，IL-10 ELISA kit(博士德)。

1.2 昆明鼠分組 Ⅰ組:對(duì)照組(20只)，分為ⅠA組:健康對(duì)照(10只)、ⅠB組:單次直接致死劑量LPS(2LD50=8 mg/kg)對(duì)照組(10只);Ⅱ組:標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素耐受組(6只);Ⅲ組:高劑量Dex干預(yù)組(12只)，ⅢA組為初始LPS刺激前高劑量Dex干預(yù)組(6只)，ⅢB組為終末致死量LPS前高劑量Dex干預(yù)組(6只);Ⅳ組:低劑量Dex干預(yù)組(12只)，ⅣA組為初始LPS刺激前低劑量Dex干預(yù)組(6只)，ⅣB組為終末致死量LPS前低劑量Dex干預(yù)組(6只)。

1.3 各組處置 ⅠA組小鼠:連續(xù)5 d腹腔注射0.9%氯化鈉注射液(0.5 mL/d)。ⅠB組小鼠:連續(xù)4 d腹腔注射0.9%氯化鈉注射液(0.5 mL/d)，第5天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg)。Ⅱ組小鼠:連續(xù) 4 d 腹腔注射 LPS［80 μg/(kg·d)］，第5 天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg)。ⅢA組小鼠:連續(xù)4 d 腹腔注射 LPS［80 μg/(kg·d)］，第 1 天注射LPS前1 h腹腔注射Dex(10 mg/kg)，第5天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg);ⅢB組小鼠:連續(xù)4 d 腹腔注射 LPS［80 μg/(kg·d)］，第 5 天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg)，注射致死量LPS前1 h腹腔注射Dex(10 mg/kg)。ⅣA組小鼠:連續(xù)4 d腹腔注射 LPS［80 μg/(kg·d)］，第 1 天注射 LPS前1 h腹腔注射Dex(1 mg/kg)，第5天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg)。ⅣB組小鼠:連續(xù)4 d腹腔注射 LPS［80 μg/(kg·d)］，第 5 天腹腔注射致死劑量LPS(8 mg/kg)，注射致死量LPS前1 h腹腔注射Dex(1 mg/kg)。于第5天注射致死量LPS后3 h采用摘眼球法取血標(biāo)本，留取血清，4℃保存，次日檢測(cè)血清細(xì)胞因子。

1.4 TNF-α和IL-10水平測(cè)定 取血清標(biāo)本，依照博士德ELISA kit說(shuō)明書具體操作，檢測(cè)OD值，應(yīng)用curve exert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得濃度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析，計(jì)量資料均采用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

①ⅠA組 TNF-α、IL-10水平極低，ⅠB組TNF-α、IL-10水平較ⅠA組顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ⅱ組TNF-α、IL-10水平較ⅠB組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍高于ⅠA組，見(jiàn)表1。②Dex干預(yù)組TNF-α水平與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素耐受組比較(表2):ⅢA、ⅣA組 TNF-α 水平與Ⅱ組 TNF-α水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，ⅢB、ⅣB組TNF-α水平低于Ⅱ組TNF-α水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。③Dex干預(yù)組IL-10水平與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素耐受組比較(表2):ⅢA、ⅣA組IL-10水平高于Ⅱ組IL-10水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，ⅢB、ⅣB組IL-10水平與Ⅱ組IL-10水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。由于部分血樣溶血或獲取血清量少，檢測(cè)血清樣本數(shù)量與各組小鼠數(shù)量有差異。

表1 健康對(duì)照組、LPS對(duì)照組及標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素耐受組TNF-α、IL-10水平比較

表2 地塞米松干預(yù)各組與標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素耐受組TNF-α、IL-10 水平比較

3 討論

內(nèi)毒素耐受現(xiàn)象是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成的一種保護(hù)性調(diào)節(jié)機(jī)制，以避免機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，是機(jī)體防御機(jī)制的重要組成部分［1］。此外，在生命的早期過(guò)程中不可避免地接觸到的環(huán)境內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體免疫耐受的調(diào)節(jié)也具有重要作用［3］。人工誘導(dǎo)針對(duì)內(nèi)毒素的免疫耐受可能具有改善自身免疫性疾病的作用［3-5］。內(nèi)毒素耐受現(xiàn)象的機(jī)制目前沒(méi)有被完全闡明，大量研究表明，單核巨噬細(xì)胞系是內(nèi)毒素作用的主要靶細(xì)胞，此外，樹突細(xì)胞與內(nèi)毒素耐受也具有密切關(guān)系。內(nèi)毒素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)主要為Toll樣受體4(TLR4)識(shí)別后與髓樣分化因子-88(MyD88)銜接，進(jìn)一步與白介素-1受體相關(guān)激酶(IRAKs)、TNF受體相關(guān)因子-6(TRAF-6)作用，激活NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)和絲裂素活化蛋白激酶(MAPKs)，導(dǎo)致NF-κB和JNK活化，轉(zhuǎn)錄因子向核內(nèi)易位，基因表達(dá)，最終導(dǎo)致炎癥因子的釋放。目前主要認(rèn)為內(nèi)毒素耐受與TLR4表達(dá)下調(diào)、IRAK水平下調(diào)、MAPK活性降低、NF-κB 活化障礙具有相關(guān)性［1］。

GC常被用于治療感染性休克、全身炎癥反應(yīng)綜合征等，以減輕炎癥反應(yīng)，GC的應(yīng)用也將影響到內(nèi)毒素耐受形成。GC對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)具有廣泛而重要的調(diào)節(jié)作用。GC對(duì)誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受的作用仍存在爭(zhēng)議。Glenn等［6］研究表明，切除腎上腺的鼠不能形成對(duì)LPS的耐受，通過(guò)補(bǔ)充外源性糖皮質(zhì)激素能夠恢復(fù)鼠對(duì)LPS的耐受能力。Raquel等［7］研究表明，在Dex條件下，樹突細(xì)胞保持在未成熟狀態(tài)，促進(jìn)免疫耐受。Rearte等［2］研究表明，內(nèi)毒素耐受的持久性依賴于GC，但Dex對(duì)內(nèi)毒素耐受的形成具有抑制作用。上述這些體外或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果不盡相同，這可能與內(nèi)毒素耐受產(chǎn)生過(guò)程的復(fù)雜性相關(guān)，可能研究結(jié)果只來(lái)自于內(nèi)毒素耐受的一個(gè)特殊階段，或與應(yīng)用不同的動(dòng)物模型、選擇外源性糖皮質(zhì)激素干預(yù)的方法不同、應(yīng)用試劑及檢測(cè)方法不同相關(guān)。

TNF-α被認(rèn)為與內(nèi)毒素耐受密切相關(guān)，目前絕大部分研究表明，機(jī)體第一次受到LPS刺激時(shí)TNF-α顯著升高，形成內(nèi)毒素耐受時(shí)TNF-α升高水平明顯降低，機(jī)制可能與內(nèi)毒素耐受時(shí)IRAKs表達(dá)下降，IRAK/MyD88結(jié)合被抑制，NF-κB活化障礙相關(guān)［1］。Rearte等［2］通過(guò)抗 TNF-α 抗體不能改變LPS誘導(dǎo)耐受的實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了TNF-α與內(nèi)毒素耐受雖然相關(guān)，但其不是耐受建立的相關(guān)責(zé)任細(xì)胞因子。盡管對(duì)TNF-α是否能誘導(dǎo)耐受觀點(diǎn)不一致，但內(nèi)毒素耐受時(shí)TNF-α升高水平顯著降低這一事實(shí)是絕大數(shù)研究公認(rèn)的，本實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了，當(dāng)小鼠第一次受到LPS刺激時(shí)，TNF-α水平顯著升高，多次LPS干預(yù)，形成內(nèi)毒素耐受，小鼠受到致死量LPS打擊時(shí)TNF-α升高水平明顯下降。外源性糖皮質(zhì)激素-地塞米松能夠抑制TNF-α的產(chǎn)生，我們?cè)O(shè)想在建立內(nèi)毒耐受形成過(guò)程中在不同的時(shí)間點(diǎn)予Dex干預(yù)，是否仍能夠抑制TNF-α的產(chǎn)生，促進(jìn)內(nèi)毒素耐受。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在初始LPS刺激前1 h，給予高劑量Dex(10 mg/kg)或低劑量Dex(1 mg/kg)干預(yù)均不影響TNF-α水平，即在較早期給予Dex干預(yù)，并不影響接下來(lái)內(nèi)毒素耐受的建立。然而，終末致死量LPS前高劑量或低劑量Dex干預(yù)能顯著降低TNF-α水平，即注射致死量?jī)?nèi)毒素前1 h腹腔注射Dex能進(jìn)一步降低TNF-α水平，對(duì)內(nèi)毒素耐受有促進(jìn)作用，同時(shí)也說(shuō)明了1 mg/kg Dex與10 mg/kg Dex劑量對(duì)TNF-α水平影響無(wú)顯著差異，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Glenn等［6］認(rèn)為Dex對(duì)內(nèi)毒素耐受起到是促進(jìn)作用的結(jié)論一致，但不同點(diǎn)在于其動(dòng)物模型為腎上腺切除鼠，除外了內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素的干擾，其結(jié)論認(rèn)為在初始LPS刺激前予Dex能恢復(fù)內(nèi)毒素耐受能力。然而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在終末致死量LPS攻擊前的一定時(shí)段內(nèi)Dex干預(yù)能通過(guò)降低TNF-α水平促進(jìn)內(nèi)毒素耐受，而過(guò)早給予Dex干預(yù)則不能對(duì)內(nèi)毒素耐受的TNF-α水平產(chǎn)生顯著影響。

IL-10作為抗炎細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)炎癥免疫反應(yīng)中具有重要作用。Randow等［8］通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，人體單核細(xì)胞的耐受可以通過(guò)IL-1、IL-10、TGF-β前處理被部分模仿，在耐受過(guò)程中應(yīng)用抗IL-10或抗TGF-β抗體可阻止這一現(xiàn)象產(chǎn)生，而IL-10缺失則會(huì)使樹突細(xì)胞缺乏對(duì)LPS的反應(yīng)，損毀免疫耐受［9］，由此提示IL-10是內(nèi)毒素耐受形成過(guò)程中的重要細(xì)胞因子。然而，有研究表明，IL-10基因敲除小鼠仍能產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受［10］，此結(jié)果提示我們IL-10的存在并不是內(nèi)毒素耐受的必要條件。Rearte等［2］的研究也認(rèn)為IL-10并不是耐受維持至關(guān)重要的細(xì)胞因子，在小鼠產(chǎn)生內(nèi)毒素耐受時(shí)，其體內(nèi)僅有低水平的IL-10。IL-10對(duì)內(nèi)毒素耐受形成的作用目前不是十分明確，在內(nèi)毒素耐受形成時(shí)IL-10水平是升高還是降低，目前仍無(wú)一致的結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)小鼠第一次受到LPS刺激時(shí)IL-10水平顯著升高，多次LPS刺激，形成內(nèi)毒素耐受，小鼠IL-10升高水平明顯下降，這一結(jié)果與Rearte等所得結(jié)論相一致，提示IL-10可能參與內(nèi)毒素耐受的形成。在終末致死量LPS前予高劑量Dex(10 mg/kg)或低劑量Dex(1 mg/kg)干預(yù)均不顯著影響IL-10水平;但在終末致死量LPS刺激前96 h給與Dex干預(yù)，使機(jī)體在內(nèi)毒素耐受形成時(shí)產(chǎn)生IL-10水平增高，推測(cè)Dex對(duì)IL-10調(diào)控作用可能需要較長(zhǎng)時(shí)間，但對(duì)內(nèi)毒素耐受時(shí)的TNF-α水平?jīng)]有顯著影響，說(shuō)明IL-10不是形成內(nèi)毒素耐受的決定性細(xì)胞因子。

內(nèi)毒素耐受產(chǎn)生機(jī)制至今仍未完全明確。目前可通過(guò)多次LPS刺激建立內(nèi)毒素耐受動(dòng)物模型，本實(shí)驗(yàn)分別于初始LPS刺激前和終末致死量LPS前予高/低劑量Dex干預(yù)內(nèi)毒素耐受形成過(guò)程，通過(guò)檢測(cè)小鼠體內(nèi)TNF-α、IL-10水平變化，間接推斷Dex對(duì)內(nèi)毒素耐受的影響，結(jié)合初始LPS刺激前予高劑量Dex或低劑量Dex干預(yù)不影響TNF-α水平，但能升高 IL-10水平，終末致死量LPS前高劑量Dex或低劑量Dex干預(yù)能降低TNF-α水平，但不影響IL-10水平。我們可得出初步結(jié)論，終末致死量LPS前較短時(shí)間內(nèi)予以Dex干預(yù)可能對(duì)促進(jìn)內(nèi)毒素耐受更有意義，同時(shí)也提示Dex劑量過(guò)高可能不會(huì)帶來(lái)更多受益，IL-10對(duì)內(nèi)毒素耐受的形成可能不具有決定作用。結(jié)合臨床，應(yīng)用大劑量激素可增加副作用發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，在高劑量激素與低劑量激素對(duì)內(nèi)毒素耐受作用無(wú)差異的情況下，我們可以考慮應(yīng)用小劑量激素治療感染性休克/敗血癥患者可能帶來(lái)更多臨床受益，這一結(jié)論與Annane等［11］主張低劑量糖皮質(zhì)激素治療敗血癥相一致。糖皮質(zhì)激素對(duì)內(nèi)毒素耐受形成的影響值得深入研究。

［1］李維朝，蔣電明，朱鳳臣，等.內(nèi)毒素耐受的分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中國(guó)免疫學(xué)，2010，26:764-768.

［2］Rearte B，Landoni V，Laborde E，et al.Differential effects of glucocorticoids in the establishment and maintenance of endotoxin tolerance［J］.Clin Exp Immunol，2010，159:208-216.

［3］Kristofor KE，Shigeki T，F(xiàn)arshid N，et al.Early life exposure to lipopolysaccharide suppresses experimental autoimmune encephalomyelitis by promoting tolerogenic dendritic cells and regulatory T cell［J］.J Immunol，2009，183:298-309.

［4］Olivier J，Sandrine R，Natacha B，et al.Dendritic cells modulated by innate immunity improve collagen-induced arthritis and induce regulatory T cells in vivo［J］.Immunology，2008，126:35-44.

［5］趙欣欣，畢瑩，閔睿，等.內(nèi)毒素抑制膠原誘導(dǎo)的鼠關(guān)節(jié)炎［J］.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2011，31:689-690.

［6］Glenn F，Evans，Zuckerman SH，et al.Glucocorticoid-dependent and independent mechanisms involved in lipopolysaccharide tolerance［J］.Eur J Immunol，1991;21:1973-1979.

［7］Cabezon R，Ricart E，Espana C，et al.Gram-negative enterobacteria induce tolerogenic maturation in dexamethasone conditioned dendritic cells［J］.PLoS One，2012，7:e52456.

［8］Randow F，Syrbe U，Meisel C，et al.Mechanism of endotoxin desen-sitization:involvement of interleukin 10 and transforming growth factor beta［J］.J Exp Med，1995，181:1887-1892.

［9］Fang Z，Bogoljub C，Hongmei Li，et al.IL-10 deficiency blocks the ability of LPS to regulate expression of tolerance-related molecules on dendritic cells［J］.Eur J Immuno，2012，42:1449-1458.

［10］Berg DJ，Kuhn R，Rajewsky K，et al.Interleukin-10 is a central regulator of the response to LPS in murine models of endotoxic shock and the Shwartzman reaction but not endotoxin tolerance［J］.J Clin Invest，1995，96:2339-2347.

［11］Annane D，Bellissant E，Bollaert PE，et al.Corticosteroids in the treatment of severe sepsis and septic shock in adults:a systematic review［J］.JAMA，2009，301:2362-2375.