棉花煙霧吸入性急性肺損傷大鼠模型的建立

韓志海，段蘊鈾，姜 毅，王曉陽，方庭正，黃 燕

煙霧吸入性急性肺損傷是指在火災等煙霧環(huán)境下因吸入有毒氣體導致呼吸系統(tǒng)發(fā)生病理生理改變，如肺泡壁增厚、肺泡腔及肺泡間隔蛋白滲出、炎癥細胞聚集、肺水腫，臨床表現為呼吸困難、低氧血癥、呼吸衰竭，嚴重者可發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征，病死率高，是呼吸及危重病科治療中的難題，同時也是戰(zhàn)傷研究的熱點之一[1-2]。

急性肺損傷的動物模型大多以動脈血氧分壓降低和肺組織病理損傷為主要標準。因煙霧吸入性肺損傷多發(fā)生于火災中而易合并燒傷，且兩者合并傷的病死率更高，所以國外的動物模型中同時予以煙霧吸入和皮膚的燒傷[3-5]來造模。本實驗參考文獻[5-7]，予以科學改進，成功制作了大鼠棉花煙霧吸入性急性肺損傷模型。

1 材料與方法

1.1 材料 溫度可調式鈦合金錫爐(富迪牌，HT-B型，功率150 W，內徑50 mm，深度30 mm，廣東宏泰電子五金工具廠);數顯溫度計(宏海牌，XMT-280型，北京宏海永昌儀表技術開發(fā)中心，量程-50～500℃);集煙筒(自制，內徑70 mm、高110 mm圓筒，頂端開口直徑12 mm接冷卻管，底端敞開，距底端5 mm的側壁等間隔開直徑5 mm的3個孔用于燃燒時吸入空氣);冷卻管(紫銅管，內徑10 mm，壁厚1 mm，長度500 mm，兩端設計接口);風扇;棉花(陽光純棉牌新疆一級長絨棉);電子天平(JD100-3型，沈陽龍騰電子有限公司);分煙管(自制，直徑30 mm、壁厚2 mm、長500 mm亞克力管，兩端接內徑3 mm接頭，一側管壁等距離開2個孔接內徑8 mm接頭);吸煙瓶(自制，內徑62 mm、高180 mm圓形塑料瓶，中央剪開，瓶口開孔接分煙管，瓶身開孔接軟管至廢氣袋);廢氣袋(自制，80 cm×90 cm×40 cm收納袋，開口處接內徑3 mm接頭)。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(嘉美生物技術有限公司)，按試劑盒說明進行操作。丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;二辛可酸(bidnchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Bipec公司;倒置顯微鏡(日本，Nikon公司);酶標儀、電泳及轉膜裝置(美國，Bio-Rad公司)。

1.2 實驗動物及分組 清潔級健康成年雄性SD大鼠共24只，體質量150～250 g，軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心[SCXK-(軍)-2012-0004]提供，海軍總醫(yī)院實驗動物中心[SCXK-(軍)-2012-0012]飼養(yǎng)，各組大鼠體質量經統(tǒng)計分析差異無統(tǒng)計學意義。遵守實驗動物條例處置動物，按照隨機化原則將動物分組，分為對照組及3h、6h、24h組，每組6只。

1.3 煙霧吸入 連接好煙霧吸入裝置后，取大鼠2只分別置入吸煙瓶中，錫爐預熱至300℃恒溫，稱取2 g棉花放入錫爐內，立即蓋上集煙筒，啟動風扇，開始計時2 min，見大鼠足底皮膚逐漸出現櫻紅色至紫紅色，并有躁動、呼吸急促、張口呼吸，至出現呼吸深慢、張口喘鳴時或滿2 min時限時，予以停止吸煙;立即敞開吸煙瓶口，吸入空氣7 min，可見大鼠呼吸困難表現逐漸好轉。3h、6h、24h組重復上述步驟3～5次，至大鼠吸入空氣7 min仍舊昏迷不醒時結束。對照組無棉花燃燒過程，重復上述步驟5次(圖1)。

圖1 大鼠煙霧吸入性肺損傷模型

1.4 血氣分析 大鼠在脫離煙霧環(huán)境后呼吸室內空氣，予以皮下注射生理鹽水2 mL，自由活動及飲食。3h、6h、24h 組分別在煙霧吸入3、6、24 h 后給予腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，麻醉生效后腹主動脈取動脈血1.5 mL送檢，查血液pH值、動脈血氧分壓(partial pressure of oxygen in arterial，PaO2)、二氧化碳分壓(pressure of carbon dioxide，PaCO2)等指標。對照組大鼠在模擬煙霧吸入24 h后予以行血氣分析。

1.5 支氣管肺泡灌洗液ELISA檢測 抽取動脈血氣后的大鼠放血致死，從大鼠胸正中線開胸后分離并夾閉氣管，剝離大血管，完整取出全肺，結扎右主支氣管，取長50 mm、22 G硅膠管行氣管插管灌注冷無菌生理鹽水行左肺灌洗，2 mL注入，回收1.5～1.8 mL，1 500 r/min 4 ℃離心10 min，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)上清液進行ELISA檢測。

1.6 肺葉處理 分離右肺各葉，右肺上葉、下葉分別置冷凍管內，液氮凍存;右肺中葉予以4%多聚甲醛溶液浸泡72 h后石蠟包埋，切片行蘇木素和伊紅染色。

1.7 ELISA法檢測BALF、右肺下葉肺組織勻漿中炎癥介質及細胞因子水平 取大鼠BALF上清液及右肺下葉肺組織勻漿，采用雙抗體夾心BCA-ELISA法檢測 BALF 中白介素(Interleukin，IL)-1β、IL-8、右肺下葉勻漿中髓過氧化物酶(myeloperoxide，MPO)。采用比色法檢測SD大鼠右肺下葉肺組織勻漿MDA濃度。采用BCA法檢測SD大鼠BALF中總蛋白。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 18.0軟件，計量資料的比較采用單因素方差分析，LSD法進行各組間的兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠動脈血氣分析結果 各組間PaO2的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，3h、6h、24h 組大鼠的PaO2均明顯低于對照組(P＜0.001)，尤其是 3h、6h組PaO2低于60 mmHg，此時的吸入氧約為21%，計算氧合指數低于300 mmHg，符合急性肺損傷的血氣診斷標準。血液pH值、HCO3-及碳氧血紅蛋白(carboxyhemoglobin，HbCO)均在煙霧吸入后立即下降，但24 h后基本恢復正常。而PaCO2差異無統(tǒng)計學意義(表1)。

表1 各組大鼠體質量及血氣分析(±s，n=6)

表1 各組大鼠體質量及血氣分析(±s，n=6)

注:與對照組比較，*F 值依次為 17.857、30.666、7.018、28.321，*P 均＜0.001

組別 pH PaO2(mmHg) PaCO2(mmHg) HCO3-(mmol/L) HbCO(%) 體質量(g)對照組 7.339 ± 0.015 97.68 ± 3.44 40.97 ± 4.21 21.83 ± 2.62 0.00 178.43 ± 23.88 3h 組 7.179 ± 0.066* 56.05 ± 10.26* 45.48 ± 12.30 16.65 ± 4.43* 1.58 ± 0.64* 183.82 ± 34.74 6h 組 7.308 ± 0.034 58.22 ± 6.06* 46.08 ± 2.94 22.65 ± 2.42 0.93 ± 0.16* 169.47 ± 14.07 24h 組 7.321 ± 0.037 68.22 ± 11.57* 46.30 ± 5.69 24.60 ± 2.65 0.20 ± 0.09 200.73 ± 30.10

2.2 大鼠BALF及肺組織勻漿中指標檢測 BALF中IL-1β和肺組織勻漿中MPO在3h、6h、24h組均明顯高于對照組。BALF中IL-8、總蛋白定量和肺組織勻漿中MDA濃度在6h、24h組明顯高于對照組，而3h組較對照組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠BALF及肺組織勻漿中炎癥指標檢測s，n=6)

表2 各組大鼠BALF及肺組織勻漿中炎癥指標檢測s，n=6)

注:與對照組比較，*F 值依次為 36.24、49.38、52.46、28.06、26.82，*P 均＜0.05

組別 BALF IL-1β(pg/mL) 肺MPO(ng/mL) BALF IL-8(pg/mL) BALF總蛋白(mg/mL) 肺MDA(nmol/mL)對照組 41.76 ± 6.02 306.64 ± 62.23 201.97 ± 37.34 504.45 ± 170.18 173.02 ± 35.20 3h 組 54.57 ± 2.87* 400.61 ± 65.42* 212.11 ± 25.88 963.41 ± 96.23 231.92 ± 30.26 6h 組 75.06 ± 9.02* 553.67 ± 64.82* 420.53 ± 94.97* 2349.67 ± 521.61* 347.39 ± 41.51*24h 組 75.61 ± 7.44* 647.11 ± 91.79* 903.59 ± 203.40* 3002.69 ± 560.00* 544.72 ± 138.14*

2.3 肺組織大體及病理組織觀察

2.3.1 肺組織大體觀 對照組大鼠肺組織顏色均勻、淡粉紅色，組織質地柔軟、彈性好，未見腫脹、出血及壞死;3h組大鼠肺組織輕度腫脹，粉紅色為主，可見多處斑片狀出血灶;6h組大鼠肺組織見明顯充血、水腫，表面大部分彌漫鮮紅色至深紅色出血，肺葉邊緣尚無明顯病變;24h組大鼠肺組織極度腫脹，彌漫性充血、出血，肺組織彈性差，肺質量明顯增加。見圖2。

2.3.2 肺組織病理學觀察 對照組大鼠肺泡結構清晰、完整，腔內無滲出，肺泡間隔無腫脹、均勻一致;3h組大鼠肺泡結構稍有破壞，肺泡腔內未見出血和滲出物，血管擴張，肺泡間隔腫脹，炎癥細胞浸潤;6h組及24h組大鼠肺泡結構彌漫性破壞，腔內可見透明膜及漏出的紅細胞，肺泡間隔增厚，炎癥細胞浸潤明顯，24h組較6h組病變更加嚴重。見圖3。

圖2 肺組織大體觀

3 討論

煙霧吸入可主要歸納為以下3個致傷因素:一是熱量，吸入的干熱或濕熱空氣直接造成呼吸道黏膜、肺實質的損傷，如導致聲門水腫可引起窒息[8]。二是缺氧，因缺氧或吸入窒息劑如一氧化碳引起窒息是火災中常見的死亡原因;三是顆粒和毒性物質，其中直徑小于1 μm的顆粒可以到達肺泡腔，引起呼吸道黏膜的直接損傷和廣泛的全身中毒反應。煙霧吸入激活了熱應激、缺氧應激、氧化應激及基因毒應激這些常見的細胞應激反應，以產生各種細胞因子來對抗和減輕損害、修復損傷，維護內環(huán)境的穩(wěn)定，但在病理情況下細胞應激同樣也是造成繼發(fā)損傷的原因。目前認為，顆粒和毒性物質是導致煙霧吸入性肺損傷病理生理改變的“罪魁禍首”，這些物質與肺實質發(fā)生交互反應介導了炎癥瀑布反應，導致肺水腫、氣道塑型、氣道阻塞、缺氧性肺血管收縮功能喪失和通氣/血流比例失調。其中氧化應激和炎癥反應是煙霧吸入性損傷中的2個關鍵環(huán)節(jié)。

煙霧吸入誘發(fā)的急性肺損傷研究中有很多動物模型，發(fā)煙物質的種類不同導致煙霧成分復雜，如有害氣體芥子氣的致傷、黑火藥燃燒致傷、高分子有機聚合材料燃燒致傷等，其致傷機制也各有側重，因為熱量大部分在聲門上被消耗，極少能夠抵于聲門或抵于隆突而到達肺組織，因此在造模中除去了熱量的影響。因煙霧成分的復雜性，本實驗選擇了常用的棉花燃燒產煙，也部分代表了棉織料的衣服和家紡在火災中的燃燒產煙。選擇棉花作為造模的燃燒物也參考了既往的文獻，大鼠吸入棉花燃燒后的煙霧，4 h即可出現肺濕干重比的升高。提示肺水腫，并且肺內中性粒細胞數也比對照組增高，類似人類煙霧性肺損傷中的炎癥反應[8]。

在評價肺損傷時本研究選擇動脈血氧飽和度、肺組織大體及病理切片觀察等直觀的指標，實驗結果提示在煙霧吸入后3 h即有肺氣體交換功能的降低，至24 h仍明顯低于正常水平;同時肺組織大體及病理切片在煙霧吸入后3 h即出現損傷性表現，并逐漸加重，至24 h時十分明顯，但此時動脈血氧分壓對比致傷后3h、6h組有所升高，考慮為動脈血中一氧化碳濃度降低減輕了對氧氣的競爭所致。本研究還選擇了BALF中的IL-1β、IL-8、總蛋白和肺組織勻漿中MDA、MPO作為肺損傷的評價指標[9-10]。IL-1β為前炎癥因子，在損傷早期由單核巨噬細胞釋放，能夠引起IL-8的釋放;后者激活中性粒細胞募集到肺，引發(fā)炎癥反應和肺損傷，當肺毛細血管-肺泡膜損傷后，血漿中蛋白釋放到肺泡腔中，引起B(yǎng)ALF中蛋白升高，引起肺水腫及透明膜的形成。MDA是脂質過氧化損傷的產物，其升高為活性氧等自由基損傷細胞的膜結構，提示氧化應激損傷加劇。MPO主要由中性粒細胞釋放出來，其升高反映了炎癥反應的程度。在本實驗中上述指標均明顯升高，提示氧化應激和炎癥反應的增強，與人類的煙霧吸入性肺損傷表現[11-12]類似，說明本煙霧吸入性肺損傷模型成功建立，可以用于評價不同干預措施對大鼠棉花煙霧吸入性肺損傷的影響。

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