人間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子鞘內(nèi)注射治療新生兒中-重度缺氧缺血性腦病1例

王 鳳，欒 佐

我國(guó)新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)發(fā)生率為活產(chǎn)兒的 3‰～6‰，其中15%～20%在新生兒期死亡，存活者中25%～30%可能留有不同類型和程度的遠(yuǎn)期后遺癥［1］。在原有常規(guī)對(duì)癥支持治療基礎(chǔ)上，目前治療進(jìn)展涵蓋了亞低溫及神經(jīng)干細(xì)胞移植。亞低溫的治療對(duì)象多局限在大于34周、適應(yīng)證為中-重度腦損傷［2-3］。越來越多的證據(jù)表明，新生兒腦部缺氧損傷后，很難再生性修復(fù)，這可能與腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的損失、神經(jīng)血管生長(zhǎng)及分化因子的表達(dá)受到影響有關(guān)。在過去的幾年，干細(xì)胞移植尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞在增強(qiáng)新生兒神經(jīng)元再生能力方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，通過增強(qiáng)不成熟大腦內(nèi)源性再生能力，修復(fù)病變，改善遠(yuǎn)期肌張力及運(yùn)動(dòng)發(fā)育水平。比起成人腦病，新生兒腦病用干細(xì)胞治療效果更好［4］。而在前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，數(shù)據(jù)顯示脂肪干細(xì)胞分泌的具有生物活性的因子如胰島素樣生長(zhǎng)因子以及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子無(wú)論是在體外還是體內(nèi)神經(jīng)損傷模型中，均表現(xiàn)出對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用［5-6］。2013年10月5日，我科為1例中-重度缺氧缺血性腦病患兒成功進(jìn)行了人間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子鞘內(nèi)注射治療，近期療效滿意，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒，男性，生后1.5 h因“窒息復(fù)蘇后呼吸急促、膚色青紫”入院。病史:羊水Ⅲ度糞染、臍帶呈螺旋狀扭轉(zhuǎn)。生后Apgar評(píng)分1 min 4分(呼吸－2分，反射－1分，膚色－1分，肌張力－1分，心率－1分)，立即予氣管插管胎糞吸引，之后給予復(fù)蘇囊正壓通氣及刺激呼吸;5 min 6分(呼吸－1分，反射－1分，膚色－1分，肌張力－1分);10 min 9分(膚色－1分)。入院時(shí)神經(jīng)系統(tǒng)查體:嗜睡、易激惹，前囟平軟，瞳孔縮小，四肢肌張力高，原始反射減弱;血?dú)夥治?鼻導(dǎo)管吸氧為60%、流量0.5 L/min):pH 7.14，動(dòng)脈氧分壓155 mmHg，二氧化碳分壓31 mmHg，乳酸＞15 mmol/L，堿剩余－17.1 mmol/L，鈣離子1.37 mmol/L，血糖 7.8 mmol/L，碳酸氫根10.6 mmol/L。治療前頭顱CT示腦實(shí)質(zhì)呈彌漫性低密度影伴腦室變窄。腦電圖呈現(xiàn)低電壓。生后第6天腦電圖在睡眠中可見一過性額區(qū)尖波，且可見非連續(xù)圖形(trace discontinuous，TD)、交替性圖形(trace alternant，TA)。診斷:新生兒窒息;新生兒缺氧缺血性腦病;胎糞吸入綜合征;新生兒代謝性酸中毒。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞因子來源 干細(xì)胞活性因子來源于體外培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞。吸脂術(shù)后吸取的脂肪組織經(jīng)Ⅰ型膠原酶消化后接種培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，適度傳代后進(jìn)行干細(xì)胞活性因子的收集，因子富集后行微生物檢測(cè)證實(shí)其無(wú)污染，并采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)主要因子含量(腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)。

1.2.2 操作過程 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。術(shù)前簽署知情同意書。根據(jù)其窒息缺氧病史、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、完善頭顱CT明確缺氧缺血性腦病診斷各類檢查，于患兒出生12 h予干細(xì)胞活性因子自L4-L5椎間隙行鞘內(nèi)注射，每次0.75 mL緩慢注入，每24 h 1次，連續(xù)3次，同時(shí)抽吸等量的腦脊液，后常規(guī)消毒、覆蓋無(wú)菌輔料。1.2.3 評(píng)估方法 形態(tài)學(xué):頭顱MRI;電生理:腦電圖;臨床評(píng)價(jià):癥狀體征觀察、神經(jīng)行為評(píng)分(neonatal behavior neurological assessment，NBNA，大于 35分為正常范圍)，智力及運(yùn)動(dòng)發(fā)育量表評(píng)估;智力:貝利評(píng)估量表;運(yùn)動(dòng)評(píng)估:Peabody運(yùn)動(dòng)發(fā)育評(píng)估量表。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效 患兒接受干細(xì)胞活性因子注射前處于嗜睡狀態(tài)、肌張力高、自主活動(dòng)少，在接受干細(xì)胞活性因子鞘內(nèi)注射后48 h內(nèi)神志及肌張力逐漸改善，注射后第3天神志清楚、自主活動(dòng)增多，治療后第7天自主活動(dòng)正常，治療后第14天肌張力正常(表1)。隨訪至生后9個(gè)月，患兒可獨(dú)站、扶走，尋找盒子里面的東西，遵照命令將方木放入茶杯，模仿亂寫、模仿用勺子、推動(dòng)小汽車、能說2個(gè)詞。無(wú)其他不良反應(yīng)。

表1 鞘內(nèi)注射干細(xì)胞活性因子前后臨床癥狀觀察

2.2 輔助檢查 患兒注射干細(xì)胞活性因子前腦電圖呈現(xiàn)低電壓表現(xiàn)，注射后腦電波幅改善，睡眠中可見一過性額區(qū)尖波，可見TA、TD(圖1)。注射后第28天復(fù)查頭顱MRI可見腦室大小及灰白質(zhì)成像(圖2)。

圖1 鞘內(nèi)注射干細(xì)胞活性因子前后腦電圖

圖2 鞘內(nèi)注射干細(xì)胞活性因子前頭顱CT與注射后顱腦MRI

3 討論

新生兒HIE是由于缺氧窒息導(dǎo)致的腦缺血性損害。缺氧后腦血流動(dòng)力學(xué)改變、腦細(xì)胞能量代謝衰竭、自由基損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸的“興奮毒”作用及炎癥細(xì)胞、炎癥細(xì)胞因子的作用均導(dǎo)致腦細(xì)胞損傷，引起臨床一系列腦病的表現(xiàn)。本例有明確可導(dǎo)致胎兒宮內(nèi)窘迫的異常產(chǎn)科病史，以及嚴(yán)重的胎兒宮內(nèi)窘迫表現(xiàn)(胎心＜100/min，持續(xù)5 min以上;羊水Ⅲ度污染);出生時(shí)有窒息史，Apgar評(píng)分1 min 4分，出生后5 min仍需要繼續(xù)復(fù)蘇;生后不久出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，并持續(xù)24 h以上，意識(shí)改變(嗜睡)、肌張力改變(增高)，原始反射減弱，且7 d后神經(jīng)系統(tǒng)癥狀未完全消失:可診斷為中-重度缺氧缺血性腦病。為避免患兒腦損傷后遺癥發(fā)生，對(duì)患兒急性期進(jìn)行了人間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子鞘內(nèi)注射治療，療效較好。

近年來，大量臨床研究均表明，人神經(jīng)干細(xì)胞在多種系統(tǒng)治療方面具有較好療效，但其移植路徑、治療時(shí)間窗、體內(nèi)植入水平控制、倫理學(xué)、移植細(xì)胞種類、遠(yuǎn)期致瘤性均仍存在爭(zhēng)議［7-11］。動(dòng)物研究資料表明，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子如粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1［12-13］。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能通過阻斷細(xì)胞凋亡、拮抗興奮性神經(jīng)毒素作用來修復(fù)、保護(hù)缺氧、缺血時(shí)的各類神經(jīng)元，減少神經(jīng)元數(shù)目的丟失［4-5，14-15］。

對(duì)比直接移植神經(jīng)干細(xì)胞，干細(xì)胞活性因子可能具有以下優(yōu)勢(shì):①神經(jīng)元細(xì)胞在經(jīng)過缺氧缺血性損傷后可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞壞死，多在生后7 d之內(nèi)，尤其是損傷72 h之內(nèi)。目前各類研究中大部分人神經(jīng)干細(xì)胞移植都在腦損傷48 h或72 h后進(jìn)行，因?yàn)樵诖藭r(shí)間之前植入干細(xì)胞的丟失可達(dá)70%。相比之下，干細(xì)胞活性因子注射的時(shí)機(jī)不需避開細(xì)胞水腫高峰期，可盡早注入發(fā)揮作用。②干細(xì)胞活性因子的相對(duì)分子質(zhì)量小，經(jīng)腰椎穿刺進(jìn)入蛛網(wǎng)膜下腔后，更易隨腦脊液循環(huán)到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部位，從而無(wú)需側(cè)腦室穿刺，不同于直接注入異體細(xì)胞。③作為提純的干細(xì)胞活性因子，而非異體細(xì)胞本身，倫理學(xué)上更容易被接受。

根據(jù)循證醫(yī)學(xué)各證據(jù)表明，亞低溫治療能減輕神經(jīng)元的缺氧缺血性損害，目前亞低溫為治療新生兒缺氧缺血性腦病主要手段［1-3］。但亞低溫僅能減輕細(xì)胞損傷進(jìn)一步加重，做到防止細(xì)胞凋亡。而神經(jīng)細(xì)胞因子對(duì)處于凋亡程序中的神經(jīng)元細(xì)胞有逆轉(zhuǎn)作用。

文獻(xiàn)曾報(bào)道，使用藥物經(jīng)側(cè)腦室穿刺可對(duì)缺氧后的腦細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用［17-18］。本例使用的制劑含有多種濃縮的干細(xì)胞活性因子，可達(dá)到增強(qiáng)作用的效果。

人間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子治療新生兒缺氧缺血性腦病鮮見報(bào)道。本研究為個(gè)案報(bào)道，可能不能代表同類疾病患者，且很難斷定人間充質(zhì)干細(xì)胞活性因子在新生兒缺氧缺血性腦病完全康復(fù)中所起作用;同時(shí)，干細(xì)胞活性因子為生物治療，安全性與療效同樣需后續(xù)的大樣本的臨床研究，予以進(jìn)一步的研究驗(yàn)證尚需更多病例積累。尤其是干細(xì)胞活性因子對(duì)已經(jīng)死亡、損耗的神經(jīng)元細(xì)胞無(wú)法補(bǔ)充，是否提示此類治療對(duì)中-重度腦損傷、早期損傷治療效果更好，對(duì)于重度缺氧缺血性改變合并神經(jīng)干細(xì)胞移植效果更好。而目前所使用的干細(xì)胞活性因子制劑中含多種細(xì)胞因子，考慮胰島素樣生長(zhǎng)因子-1及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用最明顯［5］，是否在后期進(jìn)一步純化或者明確其他因子作用水平，均需繼續(xù)深入研究。

［1］邵肖梅，葉鴻瑁，丘小汕.實(shí)用新生兒學(xué)［M］.4版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2011:702.

［2］衛(wèi)生部新生兒疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，《中國(guó)循證兒科雜志》編輯部，等.足月兒缺氧缺血性腦病循證治療指南:2011-標(biāo)準(zhǔn)版［J］.中國(guó)循證兒科雜志，2011，6(5):327-335.

［3］孫金嶠，陳燕琳，周文浩.亞低溫治療新生兒缺氧缺血性腦病臨床效果的Meta分析［J］.中國(guó)循證兒科雜志，2009，4(4):340-348.

［4］ Donega V，van Velthoven CT，Nijboer CH，et al.The endogenous regenerative capacity of the damaged newborn brain:boosting neurogenesis with mesenchymal stem cell treatment［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2013，33(5):625-634.

［5］ Wei X，Du Z，Zhao L，et al.IFATS collection:the conditioned media of adipose stromal cells protect against hypoxia-ischemia-induced brain damage in neonatal rats［J］.Stem Cells，2009，27(2):478-488.

［6］ Nakagami H，Maeda K，Morishita R，et al.Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adiposetissue-derived stromal cells［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005，25(12):2542-2547.

［7］ Liu X，Ye R，Yan T，et al.Cell based therapies for ischemic stroke:from basic science to bedside［J］.Prog Neurobiol，2014，115:92-115.

［8］ Castillo-Melendez M，Yawno T，Jenkin G，et al.Stem cell therapy to protect and repair the developing brain:a review of mechanisms of action of cord blood and amnion epithelial derived cells［J］.Front Neurosci，2013，7:194.

［9］劉衛(wèi)鵬，屈素清，欒佐，等.人神經(jīng)前體干細(xì)胞移植治療重度腦癱患兒療效觀察［J］.中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2012，14(10):759-762.

［10］ Kim KS，Lee HJ，An J，et al.Transplantation of human adipose tissue-derived stem cells delays clinical onset and prolongs life span in ALS mouse model［J］.Cell Transplant，2013［Epub ahead of print］.

［11］ Chen G，Wang Y，Xu Z，et al.Neural stem cell-like cells derived from autologous bone mesenchymal stem cells for the treatment of patients with cerebral palsy［J］.J Transl Med，2013，11:21.

［12］ Rehman J，Traktuev D，Li J，et al.Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells［J］.Circulation，2004，109(10):1292-1298.

［13］ Sadat S，Gehmert S，Song YH，et al.The cardioprotective effect of mesenchymal stem cells is mediated by IGF-Ⅰand VEGF［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，363(3):674-679.

［14］ Escartin C，Boyer F，Bemelmans AP，et al.Insulin growth factor-1 protects against excitotoxicity in the rat striatum［J］.Neuroreport，2004，15(14):2251-2254.

［15］ Sun X，Zhou H，Luo X，et al.Neuroprotection of brain-derived neurotrophic factor against hypoxic injury in vitro requires activation of extracellular signal-regulated kinase and phosphatidylinositol 3-kinase［J］.Int J Dev Neurosci，2008，26(3/4):363-370.

［16］新生兒行為協(xié)作組.應(yīng)用20項(xiàng)新生兒行為神經(jīng)測(cè)定預(yù)測(cè)窒息兒的預(yù)后［J］.中華兒科雜志，1994，32(4):210-212.

［17］萬(wàn)國(guó)蘭，任行勤，劉鋒偉，等.頭部藥物注射療法對(duì)大鼠缺氧缺血性腦損傷后學(xué)習(xí)記憶的影響［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2007，42(2):255-257.

［18］柴斌英，劉家浩.腦室注射N-苯甲基氧化碳酰-纈氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮對(duì)新生鼠缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)作用［J］.實(shí)用兒科臨床雜志，2006，21(2):75-77.