組織培養(yǎng)獲得的海黍子幼孢子體的營養(yǎng)鹽吸收和生長特性的研究*

顧玲玲，張俊濤，劉 巖，宮慶禮，李景玉

（中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島266003）

海黍子（Sargassum muticum）隸屬于褐藻門（Phaeophyta）、褐 藻 綱 （Phaeophyceae）、墨 角 藻 目 （Fucales）、馬尾藻科（Sargassaceae）、馬尾藻屬（Sargassum），是我國黃、渤海沿岸比較常見的種類，是北太平洋西部特有的暖溫帶性海藻，除我國外還分布于千島群島、薩哈林島南岸和日本沿岸［1－3］。海黍子作為潮下帶的馬尾藻屬海藻對于魚類、貝類及蟹類等海洋生物的產(chǎn)卵、育苗和攝食具有非常重要的作用［4］。同時(shí)，海黍子還具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、醫(yī)用價(jià)值和生態(tài)價(jià)值，它是生產(chǎn)褐藻膠的原料之一［5］，具有較強(qiáng)的抗氧化活性和抗菌活性［6－7］，并可以很好的吸附重金屬［8－9］。為了保護(hù)其野生資源并滿足栽培業(yè)發(fā)展的需求，海黍子人工育苗與栽培技術(shù)的研究顯得尤為重要［10］。

海黍子人工育苗與栽培的成敗與環(huán)境因子對海黍子生長和成熟的影響密切相關(guān)。不同生長階段的海黍子對于環(huán)境因子的需求不同，由海黍子受精卵發(fā)育而來的海黍子幼體也被稱為幼孢子體。Norton發(fā)現(xiàn)水溫對海黍子幼孢子體的發(fā)育具有重要作用［11］；Steen研究了培養(yǎng)密度、營養(yǎng)物濃度及溫度對海黍子幼孢子體生長和生存的影響［12］；Hales等研究了溫度、光照強(qiáng)度和鹽度對海黍子幼孢子體的影響［13］；Wei等研究了鹽度和溫度對海黍子成體銨吸收的影響［14］。

關(guān)于海黍子的組織培養(yǎng)，Polne－Fuller通過研究得到了其深褐色愈傷組織細(xì)胞，并成功分化成了正常的幼小植株［15］，通過組織培養(yǎng)直接產(chǎn)生不定芽（從通常不形成芽的部位生出的芽）的方法在海蒿子、羊棲菜、任氏馬尾藻中已見報(bào)道［16］。利用組織培養(yǎng)方法獲得海黍子不定芽的技術(shù)對于保護(hù)海黍子野生資源和人工苗種的規(guī)?；a(chǎn)具有重要意義，但相關(guān)研究目前還未有報(bào)道。另外，水溫及氮、磷濃度等環(huán)境因子對海黍子幼孢子體生長和成熟的影響與海黍子人工苗種與栽培的成敗密切相關(guān)，但相關(guān)研究也未見報(bào)道。

本研究首先通過組織培養(yǎng)方法獲得海黍子的不定芽，再將不定芽培養(yǎng)至成熟藻體，然后利用成熟藻體通過人工采苗獲得幼孢子體。以該幼孢子為研究對象，研究了溫度和氮、磷濃度對其營養(yǎng)鹽吸收和生長的影響，不僅填補(bǔ)了相關(guān)領(lǐng)域的空白，也為利用組織培養(yǎng)方法進(jìn)行海黍子的人工繁育提供了理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 組織培養(yǎng)和幼孢子體的獲得

1.1.1 海黍子不定芽的誘導(dǎo)和培養(yǎng) 2011年9月16日于山東省青島市太平角（36°02′N；120°21′E）沿岸潮間帶石沼中采集海黍子，以其假根和莖為外植體，切除表皮并切至約2mm×1mm×1mm的規(guī)格后在20℃，光照強(qiáng)度50μmol·m－2·s－1，光周期12L∶12D，培養(yǎng)液為滅菌過濾海水的條件下誘導(dǎo)不定芽的生成，7d更換1次培養(yǎng)液。不定芽誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)第45天時(shí)，將最長葉片可達(dá)10mm的較大的不定芽從外植體上切離，移至3 000mL的三角錐形瓶中充氣培養(yǎng)，每個(gè)錐形瓶中放置3個(gè)不定芽，在20℃，光照強(qiáng)度90μmol·m－2·s－1，光周期12L∶12D，培養(yǎng)液為1／8PESI［17］，每5d更換一次培養(yǎng)液的條件下，經(jīng)過120d的充氣培養(yǎng)獲得海黍子的成熟藻體。

1.1.2 成熟藻體的采苗 2012年3月31日～4月2日對利用組織培養(yǎng)獲得的成熟藻體進(jìn)行了采苗。將載玻片平鋪在5 000mL燒杯的底部，并向燒杯中緩慢注入滅菌過濾海水4 000mL。將成熟的藻體輕輕放入該容器中，微量充氣，采苗期間不更換培養(yǎng)液。燒杯置于光照培養(yǎng)箱（GXZ－280D，寧波江南儀器廠）中，采苗條件為水溫20℃，光照強(qiáng)度50μmol·m－2·s－1，光周期12L∶12D。

1.1.3 幼孢子體的培養(yǎng) 4月2日～17日，移除成熟藻體和培養(yǎng)液后，用鑷子將附著有幼孢子體的載玻片取出并移至玻璃培養(yǎng)皿中，置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為水溫20℃，光照強(qiáng)度50μmol·m－2·s－1，光周期12L∶12D，培養(yǎng)液為1／8 PESI，其浸沒載玻片但不溢出培養(yǎng)皿即可，每3d更換一次培養(yǎng)液。靜置培養(yǎng)15d后，幼孢子體長度約為1mm。4月17日～6月6日用1／8PESI培養(yǎng)液將幼孢子體從載玻片上沖刷剝離下來，置于3 000mL的三角錐形瓶中進(jìn)行充氣培養(yǎng)，每個(gè)錐形瓶中放置約50個(gè)幼孢子體。培養(yǎng)條件同靜置培養(yǎng)。充氣培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，藻體長出3～5枚初生葉片，葉片長度達(dá)5～10mm。

1.2 幼孢子體的營養(yǎng)鹽吸收特性

向100mL的錐形瓶中加入100mL的培養(yǎng)液，然后隨機(jī)選取5～8個(gè)生長狀態(tài)良好的幼孢子體（濕重（0.043±0.003）g）移入錐形瓶中作為實(shí)驗(yàn)組。只加培養(yǎng)液未加藻體的錐形瓶作為對照組。將各處理組的錐形瓶置于振蕩器（TS－1，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）上，連同振蕩器移入光照培養(yǎng)箱中振蕩反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，收集水樣于－80℃冷凍保存。水樣中的NO－3－N、NH＋4－N和PO3－4－P濃度按《海洋監(jiān)測規(guī)范》（GB 17378.4—2007）［18］的方法測定。

1.2.1 溫度對幼孢子體氮磷吸收速率的影響 實(shí)驗(yàn)設(shè)置了10、15、20、25和30℃等5個(gè)溫度處理，每個(gè)處理4個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)液為1／4PESI，光照強(qiáng)度為50μmol·m－2·s－1。實(shí)驗(yàn)從低溫至高溫依次進(jìn)行，每個(gè)溫度處理更換培養(yǎng)液，但不更換藻體。每個(gè)溫度實(shí)驗(yàn)前，培養(yǎng)液需置于設(shè)定溫度下預(yù)冷或預(yù)熱1h。

1.2.2 氮、磷濃度對幼孢子體氮、磷吸收速率的影響實(shí)驗(yàn)設(shè)置了1／4PESI（NO－3－N、NH＋4－N、PO3－4－P濃度分別為2 834、2 686和61μg·L－1）、1／8PESI（NO－3－N、NH＋4－N、PO3－4－P濃度分別為1 796、1 454和33μg·L－1）、1／16PESI（NO－3－N、NH＋4－N、PO3－4－P濃度分別為954、265和16μg·L－1）、1／32PESI（NO－3－N、NH＋4－N、PO3－4－P濃度分別為133、144和10μg·L－1）和滅菌過濾海水（NO－3－N、NH＋4－N、PO3－4－P濃度分別為27、4和6μg·L－1）等5個(gè)營養(yǎng)鹽濃度處理，每個(gè)處理4個(gè)平行。其他實(shí)驗(yàn)條件同溫度對幼孢子體氮磷吸收速率的影響實(shí)驗(yàn)。每個(gè)處理使用不同的藻體進(jìn)行。

1.3 幼孢子體的生長特性

向500mL通氣培養(yǎng)瓶中加入500mL培養(yǎng)液，隨機(jī)選取4個(gè)生長狀態(tài)良好的幼孢子體稱量濕重后移入培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行充氣培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度50μmol·m－2·s－1，光周期12L∶12D，培養(yǎng)周期12d，每3d更換一次培養(yǎng)液并觀察記錄藻體衰敗和死亡情況。

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)置了10、15、20、25、30℃等5個(gè)溫度處理和富含 N、P的1／4PESI培養(yǎng)液和去 N、P的ASS2培養(yǎng)液［19］等2個(gè)營養(yǎng)鹽濃度處理，共計(jì)10個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)平行。

培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測定每個(gè)處理組所有存活個(gè)體的濕重，根據(jù)下列公式計(jì)算特定生長率（SGR）。

SGR＝（ln Wt－ln W0）／t×100%，

其中：W0為實(shí)驗(yàn)初始時(shí)幼孢子體的濕重（g）；Wt為實(shí)驗(yàn)

結(jié)束時(shí)幼孢子體的濕重（g）；t為實(shí)驗(yàn)周期（d）。

1.4 幼孢子體的葉綠素含量的測定

生長實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對各處理組的幼孢子體的葉綠素a、c含量進(jìn)行了測定。提取方法、測定方法以及計(jì)算方法參照張俊濤等［20］。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行處理和分析。由于所得數(shù)據(jù)不具備正態(tài)分布和方差齊性，因此采用非參數(shù)的Kruskal－Wallis檢驗(yàn)法及Scheffé多重比較法對不同溫度和氮磷濃度間的營養(yǎng)鹽吸收速率、不同溫度間的特定生長率SGR及葉綠素含量的差異顯著性進(jìn)行分析，采用非參數(shù)的 Mann－Whitney檢驗(yàn)法［21］對不同培養(yǎng)液間的特定生長率和葉綠素含量的差異顯著性進(jìn)行分析。檢驗(yàn)以P＜0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果

2.1 幼孢子體的營養(yǎng)鹽吸收特性

2.1.1 溫度對幼孢子體的氮吸收速率的影響 溫度對幼孢子體的吸收速率影響顯著（見圖1，P＜0.05），而對N吸收速率影響不顯著（P＞0.05）。的吸收速率在25～30℃范圍內(nèi)達(dá)到8.50～9.16μg·g－1·h－1，顯著高于其它溫度下的吸收速率。的吸收速率除了在10℃時(shí)為－11.74μg·g－1·h－1外，在其它溫度下均保持在20.25～29.58μg·g－1·h－1，且吸收速率在溫度間沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.1.2 溫度對幼孢子體的磷吸收速率的影響 溫度對幼孢子體的PO34－－P吸收速率影響不顯著（見圖1，P＞0.05）。在10～30℃范圍內(nèi)，其吸收速率隨著溫度的升高而增大，10℃時(shí)其吸收速率為最小值－0.09 μg·g－1·h－1，25℃時(shí)達(dá)到最大值0.97μg·g－1·h－1。

圖1 組織培養(yǎng)獲得的海黍子幼孢子體在不同溫度下的氮、磷吸收速率Fig.1 Uptake rates of ，，and at different temperatures ofyoung sporophytes of S.muticumobtained by tissue culture

2.1.3 氮濃度對幼孢子體氮吸收速率的影響 氮濃度對NH＋4－N的吸收速率影響顯著（P＜0.05），而對NO－3－N的吸收速率影響不顯著（見圖2，P＞0.05）。幼孢子體對NO－3－N和NH＋4－N的吸收速率均隨著氮濃度的升高而增大，且NO－3－N的吸收速率高于NH＋4－N的吸收速率，在實(shí)驗(yàn)濃度下兩者的吸收速率均未達(dá)到飽和。NH＋4－N的吸收速率在NH＋4－N濃度為2 686 μg·L－1時(shí)達(dá)到最大值8.02μg·g－1·h－1。而NO－3－N的吸收速率在NO－3－N濃度為2 834μg·L－1時(shí)達(dá)到最大值28.76μg·g－1·h－1。

2.1.4 磷濃度對幼孢子體磷吸收速率的影響 磷濃度對幼孢子體的PO3－4－P吸收速率影響顯著（見圖2，P＜0.05）。當(dāng)磷濃度為6～16μg·L－1時(shí)，PO3－4－P的吸收速率隨著磷濃度的升高而增大，并在16.0μg·L－1時(shí)達(dá)到飽和值3.53μg·g－1·h－1。隨著磷濃度的繼續(xù)增大，PO3－4－P的吸收速率急劇減小，當(dāng)PO3－4－P濃度為61μg·L－1時(shí)，吸收速率降至－2.31μg·g－1·h－1，顯著低于飽和值（P＜0.05）。

圖2 組織培養(yǎng)獲得的海黍子幼孢子體在不同氮、磷濃度下的氮、磷吸收速率Fig.2 Uptake rates of NO－3－N，NH＋4－N，and PO3－4－P under different nutrient levels of young sporophytes of S.muticumobtained by tissue culture

2.2 幼孢子體的生長特性

溫度和氮磷濃度對幼孢子體的特定生長率影響顯著（見圖3，P＜0.05），兩者的交互作用同樣顯著（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)期間，無論富含氮磷組還是去除氮磷組，幼孢子體均能維持正常生長。對于富含氮磷組，當(dāng)溫度為15～25℃時(shí)，其SGR為16.51%·d－1～19.58%·d－1，顯著高于10℃和30℃下的SGR（P＜0.05）。對于去除氮磷組，當(dāng)溫度為15～30℃時(shí)，其SGR為13.08%·d－1～14.58%·d－1，顯著高于10 ℃下的SGR（P＜0.05）。在溫度為15～25℃范圍內(nèi)，富含氮磷組的SGR顯著高于去除氮磷組（P＜0.05）。

圖3 組織培養(yǎng)獲得的海黍子幼孢子體在不同溫度和培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)12d后的特定生長率Fig.3 Specific growth rate after 12dculture at different1 temperatures and mediums of young sporophytes of S.muticumobtained by tissue culture

2.3 幼孢子體的葉綠素含量

氮磷濃度對葉綠素a含量影響顯著（見圖4，P＜0.05），溫度對富含氮磷組條件下的葉綠素a含量影響顯著（P＜0.05），對去除氮磷組的葉綠素a含量影響不明顯（P＞0.05），溫度和氮磷濃度的交互作用影響不顯著（P＞0.05）。富含氮磷組的葉綠素a含量在10～25℃時(shí)為0.54～0.62mg·g－1，而當(dāng)溫度上升為30℃時(shí)顯著增至最大值0.75mg·g－1（P＜0.05）。去除氮磷組的葉綠素a含量在10℃時(shí)為0.48mg·g－1，15～25℃時(shí)降低至0.33～0.35mg·g－1，30℃時(shí)回升至0.51 mg·g－1。在15～30℃范圍內(nèi)，富含氮磷組的葉綠素a含量顯著高于去除氮磷組（P＜0.05）。圖4中的虛線代表培養(yǎng)前的葉綠素含量。由圖發(fā)現(xiàn)，與培養(yǎng)前的葉綠素a含量相比，富含氮磷組的葉綠素a含量沒有明顯變化，而去除氮磷組的葉綠素a含量則明顯低于培養(yǎng)前。

葉綠素c含量受溫度影響不顯著（見圖4，P＞0.05），而受氮磷濃度的影響顯著（P＜0.05）。而兩者的交互作用對葉綠素c含量的影響不顯著（P＞0.05）。富含氮磷組的葉綠素c含量在10℃時(shí)為0.36mg·g－1，15～25℃時(shí)降低至0.22～0.24mg·g－1，30℃時(shí)回升至0.30mg·g－1。去除氮磷組的葉綠素c含量在10～25℃范圍內(nèi)隨著溫度的上升由最大值0.26mg·g－1降至最小值0.12mg·g－1，30℃時(shí)回升至0.19mg·g－1。在20～30℃范圍內(nèi)，富含氮磷組的葉綠素c含量顯著高于去除氮磷組（P＜0.05）。與培養(yǎng)前的葉綠素c含量相比，富含氮磷組的葉綠素c含量明顯高于培養(yǎng)前，而去除氮磷組的葉綠素c含量無明顯變化。

3 討論

3.1 通過組織培養(yǎng)間接獲得海黍子人工苗種的優(yōu)勢

對于自然海區(qū)的野生海黍子藻體，一般在9、10月間生出新的主枝，直至翌年1、2月間生長緩慢，3、4月間生長迅速，生殖托一般在5月開始出現(xiàn)，7～8月間繁殖［1］。利用海黍子的自然繁殖進(jìn)行人工采苗，一年中只限于一季，而且苗種的海上培育期恰逢秋、冬季節(jié)，藻體生長緩慢，這是海黍子人工苗種規(guī)?；a(chǎn)的瓶頸之一。本研究中，2011年9月16日開始利用野生海黍子的假根和莖作為外植體誘導(dǎo)不定芽，2012年3月31日由不定芽成功培育出成熟的藻體，2012年6月6日由成熟藻體通過人工采苗和培育獲得具有3～5枚初生葉，長度達(dá)5～10mm的幼孢子體。此外，作者還于2011年10和12月、2012年2和3月分別進(jìn)行了4次海黍子不定芽的誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，均成功誘導(dǎo)出不定芽。因此根據(jù)本研究的結(jié)果，利用組織培養(yǎng)的方法可以使海黍子的人工采苗不受季節(jié)限制。

另一方面，水溫對于海黍子幼苗的生長具有重要作用。根據(jù)Norton的研究，海黍子幼苗在5～10℃范圍內(nèi)生長速率僅為0.011～0.016mm·d－1，在15～25℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高其生長速率急劇增加［11］；曹淑青等報(bào)道，海黍子幼苗在水溫低于22℃時(shí)能很好的生長，但當(dāng)水溫達(dá)到23℃后幼苗的死亡率較高［10］。根據(jù)二者的報(bào)道，作者推測海黍子幼苗的最適生長溫度約為15～22℃。6～8月青島太平角海區(qū)的水溫根據(jù)作者實(shí)測的結(jié)果為17～22℃，此時(shí)將利用組培方法間接獲得的海黍子幼苗移至自然海區(qū)培養(yǎng)，必能取得較高的育苗成功率。通過組培方法間接獲得的海黍子幼孢子體具有與母體一樣的遺傳特性，盡管它的出現(xiàn)比通過自然繁殖獲得的幼孢子體提早了2個(gè)月，但其生理生態(tài)學(xué)特性應(yīng)與母體具有相似之處。因此，研究利用組培方法間接獲得的海黍子幼孢子體的營養(yǎng)鹽吸收特性和生長特性具有重要意義。

圖4 組織培養(yǎng)獲得的海黍子幼孢子體在不同溫度和培養(yǎng)液條件下培養(yǎng)12d后的葉綠素含量Fig.4 Contents of chlorophyll a and chlorophyll c after 12－day culture at different temperatures and mediums of young sporophytes of S.muticumobtained by tissue culture

3.2 海黍子幼孢子體的氮吸收特性

本研究結(jié)果顯示，在15～30℃范圍內(nèi)海黍子的幼孢子體均可吸收NO－3－N和NH＋4－N，對NO－3－N的吸收速率在15℃時(shí)達(dá)到最大值29.58μg·g－1·h－1，與鼠尾藻幼孢子體相同［20］。而對NH＋4－N的吸收速率在25℃時(shí)達(dá)到最大值9.16μg·g－1·h－1，與海黍子成體一致［14］。在10℃時(shí)二者的吸收速率降至零或負(fù)值。溫度對海黍子幼孢子體的氮吸收的影響可能與藻體的生活環(huán)境、生長階段以及相關(guān)酶的活性有關(guān)。用于組織培養(yǎng)的海黍子成體采自青島太平角沿岸潮間帶的石沼中，根據(jù)作者觀察，青島太平角海區(qū)海黍子的幼孢子體一般出現(xiàn)在6～9月份，期間的水溫實(shí)測結(jié)果為17～24℃，長期的溫度變化劇烈的環(huán)境可能是導(dǎo)致幼孢子體在較大的溫度范圍（15～30℃）內(nèi)均可進(jìn)行氮吸收得主要原因。另外，根據(jù)徐智廣的報(bào)道，溫度降低可能影響海藻對氮的吸收能力［22］，過低的溫度（10℃）可能通過抑制硝酸還原酶的活性從而影響了幼孢子體對的吸收。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)氮濃度范圍內(nèi)（0～2 834 μg·L－1），海黍子幼孢子體對NO－3－N和NH＋4－N的吸收速率隨著氮濃度的升高而增大，氮濃度－氮吸收速率曲線均呈開放型吸收模式。這可能是由于幼孢子體階段對氮的需求量較高，而開放型的吸收模式可以提高對氮的利用率。

不同形式氮的可利用性影響幼孢子體對氮的吸收。本研究中，在實(shí)驗(yàn)溫度（15～30℃）和實(shí)驗(yàn)氮濃度（0～2 834μg·L－1）范圍內(nèi)，海黍子幼孢子體對NO－3－N的吸收速率均大于對NH＋4－N的吸收速率。根據(jù)Dortch和Flynn的研究，許多大型海藻和微藻從環(huán)境中會(huì)優(yōu)先吸收NH＋4－N，并且NH＋4－N的存在會(huì)抑制對NO－3－N的吸收［23－24］。Wei研究了溫度對海黍子成體吸收NH＋4－N的影響，結(jié)果也顯示海黍子成體對NH＋4－N的吸收能力很強(qiáng)，最大值可達(dá)77.5μg·g－1·h－1［14］，這些與本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果有差異。但是Mai等評估了某馬尾藻類在藻—蝦混養(yǎng)系統(tǒng)中去除營養(yǎng)鹽的能力，結(jié)果顯示比起NH＋4－N該馬尾藻屬海藻對于NO－3－N的吸收能力更強(qiáng)［25］。有學(xué)者也發(fā)現(xiàn)米氏凱倫藻對硝酸鈉及亞硝酸鈉的利用率高于氯化銨［26］，硝酸鈉和尿素比起氯化銨更利于利瑪原甲藻的生長［27］。本研究中NO－3－N的吸收速率大于NH＋4－N的吸收速率，這可能與海藻種類及其對不同形式的氮的利用率有關(guān)。對NO－3－N的利用率較大可能與海黍子幼孢子體內(nèi)的硝酸還原酶含量和活性較高有關(guān)；同時(shí)幼孢子體階段的海黍子對營養(yǎng)鹽的需求量較大，外界的NH＋4－N含量不足以滿足其生長的需要，藻體必須依靠NO－3－N來補(bǔ)充生長的需要［28］。

3.3 海黍子幼孢子體的磷吸收特性

自然界中的藻體主要利用無機(jī)態(tài)磷，但其在細(xì)胞體內(nèi)不能直接合成，故藻類必須從外界吸收磷酸鹽以滿足生長需求，藻體內(nèi)通常會(huì)有一套應(yīng)急的磷供應(yīng)體系及相應(yīng)的調(diào)節(jié)過程來適應(yīng)環(huán)境的變化［29］。本研究的結(jié)果顯示，盡管溫度對幼孢子體的PO3－4－P吸收速率影響不顯著，但在10～25℃范圍內(nèi)，PO3－4－P的吸收速率隨著溫度的升高由負(fù)值增至最大值，而在30℃時(shí)又有所下降，這說明幼孢子體對PO3－4－P的吸收具有一定的溫度耐受限度。這可能是因?yàn)闇囟饶芨淖兗?xì)胞膜的生理特性，低溫下膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化可能會(huì)被阻礙［30］，或是相關(guān)酶的活性受到抑制，從而蛋白質(zhì)無法攜帶可溶性營養(yǎng)分子通過，進(jìn)而降低了對營養(yǎng)鹽的吸收速率［31］。根據(jù)包杰的研究，鼠尾藻對PO3－4－P的吸收速率在溫度10～25℃范圍內(nèi)隨著溫度的上升而升高［32］，Powell等也發(fā)現(xiàn)25℃對于柵藻類的PO3－4－P吸收有積極的影響［33］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。這可能與藻類利用磷酸鹽的量有關(guān)，當(dāng)溫度升高時(shí)藻類的光合磷酸化和氧化磷酸化過程都加快，所以當(dāng)磷酸鹽濃度相同時(shí)，隨著溫度的升高藻類會(huì)加快對磷酸鹽的吸收［34］。

本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)培養(yǎng)液中PO34－－P濃度在16μg·L－1以下時(shí)，而增大，而當(dāng)?shù)奈账俾蕜t隨著濃度的升高而急劇減小，甚至出現(xiàn)了負(fù)值。根據(jù)徐智廣的報(bào)道，在一定范圍內(nèi)提高PO34－－P的濃度增大了海藻對其吸收的底物濃度，導(dǎo)致其對的同化作用增強(qiáng)，從而刺激了一定范圍內(nèi)對的吸收［22］，當(dāng)?shù)臐舛壤^續(xù)增大并超過一定量時(shí)，就會(huì)對植物產(chǎn)生毒害作用，植物體內(nèi)的代謝過程將會(huì)出現(xiàn)紊亂，甚至導(dǎo)致植物死亡［35］。因此本研究中過大濃度的反而降低了藻體對的吸收甚至出現(xiàn)負(fù)吸收的情況。

3.4 溫度和氮磷濃度對海黍子幼孢子體生長的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不管是在富含氮磷條件下還是在去除氮磷條件下，溫度對于幼孢子體SGR的影響均顯著。藻類的光合作用和呼吸作用都受溫度的影響，溫度過高或過低都會(huì)影響其光合作用與呼吸作用酶的活性，所以溫度是藻類生長發(fā)育的重要因素［36］。本研究結(jié)果顯示，海黍子幼孢子體的最適生長溫度為25℃，這與 Norton和 Hales等的研究結(jié)果一致［11，13］。Eno發(fā)現(xiàn)海黍子成體的最適生長溫度也為25℃［37］，這說明海黍子幼孢子體和成體在最適生長溫度上不存在差異。

當(dāng)溫度為15～25℃時(shí)，富含氮磷組的SGR明顯高于去除氮磷組，這說明外源氮磷的適當(dāng)供給更利于幼孢子體的生長。Steen也證明了富含氮磷的培養(yǎng)液可以促進(jìn)海黍子幼孢子體的快速生長［12］。另一方面，去除氮磷組的幼孢子體在12d內(nèi)仍能保持較高的正生長率，由此推測海黍子幼孢子體生長所需的氮磷主要來源于藻體內(nèi)部的積累，而一少部分來源于外界的供給。Chapman的實(shí)驗(yàn)證明有些多年生褐藻從營養(yǎng)鹽含量較高的冬季海水中將大量的氮儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)，從而保證在營養(yǎng)鹽含量較低的冬季藻體也能快速生長［38］。Pedersen也證實(shí)墨角藻Fucus vesiculosus在氮缺乏的條件下能依靠體內(nèi)儲(chǔ)存的氮來維持生長［39］。張俊濤的研究也表明溫度15～30℃范圍內(nèi)鼠尾藻幼孢子體在沒有外界氮供給的條件下仍能維持較高的生長率［20］。

本研究發(fā)現(xiàn)，幼孢子體的SGR與藻體內(nèi)葉綠素a、c含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，尤其是去除氮磷組的葉綠素a含量實(shí)驗(yàn)后明顯低于實(shí)驗(yàn)前。由此推測葉綠素a可能是藻體內(nèi)重要的氮庫之一，當(dāng)環(huán)境條件適宜藻體快速生長時(shí)，為了滿足生長對氮的需求，藻體內(nèi)的葉綠素a分解并通過一定的途徑轉(zhuǎn)化為藻體生長所需要的氮，以致藻體內(nèi)葉綠素a含量減少。而葉綠素c含量即使在去除氮磷條件下實(shí)驗(yàn)前后變化也不大，說明葉綠素c對于海黍子幼孢子體是一種重要的光合色素，而它作為氮庫的功能較弱。這種現(xiàn)象在鼠尾藻的幼孢子體上已有報(bào)道［20］。

3.5 通過組織培養(yǎng)間接獲得海黍子苗種技術(shù)的實(shí)用性

本研究首次報(bào)道了應(yīng)用海黍子外植體誘導(dǎo)不定芽，后經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)獲得成熟藻體，并利用成熟藻體成功進(jìn)行了采苗的事實(shí)，驗(yàn)證了通過組織培養(yǎng)技術(shù)提供穩(wěn)定、充足的海黍子苗種供應(yīng)的可能性。作為多年生的海藻，海黍子的假根和莖全年存在［2］，即全年都可利用海黍子進(jìn)行組織培養(yǎng)。盡管海黍子的假根和莖的體積較小，但根據(jù)本研究結(jié)果，每株海黍子的假根和莖可以產(chǎn)生約10個(gè)外植體，而每個(gè)外植體上可以產(chǎn)生約10個(gè)不定芽，這些不定芽切離后經(jīng)過培養(yǎng)即可長成新的成熟藻體，而切除了不定芽的外植體在一定的培養(yǎng)條件下還可再生出不定芽。根據(jù)Norton等人的報(bào)道，海黍子藻體上的每個(gè)生殖托可產(chǎn)生超過300個(gè)受精卵，一株15g的藻體在它的第一個(gè)繁殖期就可放散約50萬個(gè)受精卵［40］，這些受精卵經(jīng)過培養(yǎng)即可成為生產(chǎn)用的苗種。由此推算，僅一株海黍子藻體的假根和莖就可產(chǎn)生約5 000萬株新的幼苗。組織培養(yǎng)方法具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用，技術(shù)要求低，出芽時(shí)間短，出苗效率高等特點(diǎn)。此方法除了在海黍子人工苗種規(guī)?；a(chǎn)上具有應(yīng)用前景外，在海黍子等馬尾藻屬海藻的室內(nèi)種質(zhì)保存方面也具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

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