離子液體雙水相萃取山楂黃酮和多糖的研究

鞏育軍，牛盛童，黃學(xué)鋒，王 鍵

（廣東石油化工學(xué)院，廣東 茂名525000）

離子液體雙水相體系（ionic liquid aqueous twophase system，ILATPS）一般是由親水性離子液體、無機(jī)鹽（如磷酸鹽、碳酸鹽、氫氧化物等）和水形成的雙水相體系，綜合了離子液體和雙水相體系的優(yōu)點(diǎn)[1］。作為一種高效的新型綠色分離體系，與傳統(tǒng)聚合物雙水相體系相比，具有黏度低、不揮發(fā)、對(duì)水和空氣穩(wěn)定、分相時(shí)間短、易回收利用等優(yōu)點(diǎn)，備受研究者的關(guān)注[2－6］。山楂為薔薇科（Rosaceae）植物山楂（Crataegus pinnatifida）、山 里 紅 （Crataegus pinnatifida var.major）及野山楂（Crataegrus cuneata）的干燥成熟果實(shí)，其有效成分為有機(jī)酸類、三帖類、黃酮類和多糖等[7］。研究表明山楂對(duì)治療肉食積滯、心腹刺痛、高血壓以及調(diào)節(jié)人體免疫力有顯著的功效[8］。有關(guān)山楂中有效成分的提取報(bào)道較多，均以單一成分為主，如用乙醇 提 取 總 黃 酮[9－10］、用 水 提 取 山 楂 多 糖[11－12］等。 作者以[Bmim］BF4／（NH4）2SO4雙水相為萃取體系，同時(shí)提取山楂中的黃酮和多糖，考察了離子液體濃度、（NH4）2SO4濃度、山楂用量、超聲時(shí)間等因素對(duì)萃取率的影響，為山楂總黃酮類和多糖的提取提供了新的方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

1－丁基－3－甲基咪唑四氟硼酸鹽[Bmim］BF4、硫酸銨、硝酸鋁、亞硝酸鈉、苯酚、甲醇等均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所；干燥山楂片，茂名大森林藥店。

722N型紫外可見分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠；KQ－32000DB型數(shù)控超聲波儀，昆山超聲儀器有限公司；80－1型離心沉淀機(jī)，鞏義英峪予華儀器廠；HH－601型超級(jí)恒溫水浴，江蘇金壇康華電子儀器制造廠。

1.2 山楂樣品的處理

干燥山楂片→粉碎→過60目篩→用石油醚在索氏提取器中回流4h脫脂→收集殘?jiān)娓伞鬯椤介珮悠贰?/p>

1.3 黃酮含量的測(cè)定

采用 NaNO2－Al（NO3）3－NaOH 方 法 測(cè) 黃 酮 含量[7，13］。在NaNO2存在下的堿性水溶液中，黃酮母核上的游離羥基和羰基可與鋁離子試劑反應(yīng)產(chǎn)生紅橙色絡(luò)合物。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，用紫外可見分光光度計(jì)在512nm處測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其含量。實(shí)驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合線性回歸方程為：A＝0.01175c－0.00404，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9985。

1.4 多糖含量的測(cè)定

利用苯酚－硫酸法測(cè)多糖含量[7，14］。多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，再迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，用紫外可見分光光度計(jì)在490nm下測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其含量。實(shí)驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合線性回歸方程為：A＝0.00485c＋0.09347，R2＝0.9987。

1.5 [Bmim］BF4／（NH4）2SO4 雙水相體系的配制及萃取方法

離子液體雙水相體系在恒溫25℃環(huán)境中配制，體系總體積為5mL。在10mL具塞比色管中加入山楂樣品和一定比例的[Bmim］BF4和（NH4）2SO4，加二次蒸餾水至5mL，搖勻后置于超聲儀中超聲（40kHz）萃取數(shù)分鐘，然后以2 500r·min－1離心20min后靜置，待分相完全、界面穩(wěn)定后，記錄雙水相上、下相體積，用微型刻度針管分別抽取一定量的上、下相溶液，按1.3、1.4中的方法測(cè)定吸光度，計(jì)算上、下相中山楂黃酮、多糖的濃度，按下式計(jì)算萃取率。

式中：、分別為山楂黃酮、多糖的萃取率；V1、V2分別為上、下相的體積，mL；c1、c2為上、下相中黃酮、多糖的濃度，μg·mL－1。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體濃度對(duì)萃取率的影響

在恒定溫度25℃下，固定（NH4）2SO4的濃度為0.08g·mL－1、山楂用量為0.05g、加水至5mL、超聲時(shí)間為15min，考察離子液體[Bmim］BF4濃度對(duì)山楂黃酮、多糖萃取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 離子液體濃度對(duì)山楂黃酮、多糖萃取率的影響Fig.1 Effets of concentration of ionic liguid on the extraction rate of hawthorn flavonoids and polysaccharide

由圖1可知，隨著離子液體濃度的增大，黃酮萃取率不斷增大，而多糖萃取率不斷減小。山楂黃酮屬于多酚類有機(jī)化合物，由于疏水作用，其較多分配在以離子液體膠束[15］為基本結(jié)構(gòu)的雙水相上相中，因此，[Bmim］BF4濃度越高，上相中離子液體膠束濃度越大，疏水性越強(qiáng)，雙水相上相體積也就越大，更有利于黃酮萃??；而山楂多糖中的水溶性生物大分子多糖，由于含有大量羥基等極性基團(tuán)，親水作用明顯，故較多分配在富含水鹽的雙水相下相。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著[Bmim］BF4濃度的增大，下相體積顯著減小，故多糖萃取率明顯減小。

考慮到離子液體多時(shí)會(huì)出現(xiàn)鹽不完全溶解[15］以及萃取成本增加，故確定萃取體系中適宜的[Bmim］BF4濃度為0.26～0.30g·mL－1。

2.2 （NH4）2SO4 濃度對(duì)萃取率的影響

在恒定溫度25℃下，固定離子液體[Bmim］BF4濃度為0.30g·mL－1、山楂用量為0.05g、加水至5 mL、超聲時(shí)間為15min，考察無機(jī)鹽（NH4）2SO4濃度對(duì)山楂黃酮、多糖萃取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 （NH4）2SO4濃度對(duì)山楂黃酮、多糖萃取率的影響Fig.2 Effects of concentration of ammonium sulfate on the extraction rate of hawthorn flavonoids and polysaccharide

由圖2可知，隨著（NH4）2SO4濃度的增大，黃酮萃取率不斷減小，而多糖萃取率不斷增大。這和2.1的規(guī)律恰好相反。這可能是因?yàn)?，（NH4）2SO4與離子液體競(jìng)爭(zhēng)奪取水分子[15］，使雙水相的上相體積減小，盡管黃酮的上相濃度波動(dòng)不大，但其萃取率仍然明顯減小。與此相反，由于下相體積增大，盡管山楂多糖的下相濃度變化也不大，山楂多糖萃取率仍然明顯增大。

實(shí)驗(yàn)表明，無機(jī)鹽（NH4）2SO4的非特征性鹽析作用[15］是形成離子液體雙水相體系的決定因素，（NH4）2SO4濃度太大或太小都會(huì)影響雙水相分相。綜合黃酮和多糖的萃取率變化，確定萃取體系中適宜的（NH4）2SO4濃度為0.08～0.10g·mL－1。

2.3 山楂用量對(duì)萃取率的影響

在恒定溫度25℃下，固定離子液體[Bmim］BF4濃度為0.30g·mL－1、（NH4）2SO4濃度為0.08g·mL－1、加水至5mL、超聲時(shí)間為15min，考察山楂用量對(duì)山楂黃酮、多糖萃取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 山楂用量對(duì)山楂黃酮、多糖萃取率的影響Fig.3 Effects of hawthorn dosage on the extraction rate of hawthorn flavonoids and polysaccharide

由圖3可知，在山楂用量低于0.15g區(qū)間內(nèi)，隨著山楂用量的增加，雙水相萃取黃酮和多糖的萃取率均不斷增大；但當(dāng)山楂用量超過0.15g之后，兩者均有所減小。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，山楂用量的改變，對(duì)上下相的體積基本沒有影響，但溶出的黃酮和多糖的量增加，故萃取率增大。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)山楂用量超過0.25g時(shí)，會(huì)出現(xiàn)雙水相相界面不清晰的現(xiàn)象，可能是由于雙水相體系已達(dá)最大萃取容量，這與文獻(xiàn)[4，16］的相關(guān)結(jié)論類似。故確定適宜的山楂用量為0.14～0.17g。

2.4 超聲時(shí)間對(duì)萃取率的影響

在恒定溫度25℃下，固定離子液體[Bmim］BF4濃度為0.30g·mL－1、（NH4）2SO4濃度為0.08g·mL－1、山楂用量為0.05g、加水至5mL，考察超聲時(shí)間對(duì)山楂黃酮、多糖萃取率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，在超聲萃取初期，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，山楂黃酮和多糖的萃取率均有所增大，但對(duì)于黃酮，15min后萃取率增幅已不明顯；對(duì)于多糖，20min后萃取率反而有所減小。

超聲對(duì)萃取最主要的強(qiáng)化作用在于空化效應(yīng)、熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)[17］。超聲波產(chǎn)生的高速射流和劇烈湍動(dòng)，促進(jìn)植物組織細(xì)胞變形破碎以及有效成分的迅速溶出，大大加快相相間的傳質(zhì)速度，提高萃取效率。故在有效成分未能達(dá)到最大溶出之前，超聲時(shí)間的延長(zhǎng)將促使萃取率增大，但達(dá)到某一閾值之后，萃取率將不再增大。多糖超聲20min后萃取率減小可能與超聲時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致體系溫度升高，較明顯地改變了其分配系數(shù)有關(guān)。故確定適宜的超聲時(shí)間為15～20min。

3 結(jié)論

用分光光度法研究了山楂黃酮和多糖在[Bmim］BF4／（NH4）2SO4雙水相體系中的萃取行為，考察了離子液體[Bmim］BF4濃度、（NH4）2SO4濃度、山楂用量、超聲時(shí)間等因素對(duì)萃取率的影響。確定最佳萃取條件為：離子液體[Bmim］BF4濃度0.26～0.30g·mL－1、（NH4）2SO4濃度0.08～0.10g·mL－1、山楂用量0.14～0.17g、超聲時(shí)間15～20min，在此優(yōu)化條件下，雙水相上相黃酮的萃取率為86.4%～96.0%，雙水相下相多糖的萃取率為75.2%～76.0%。[Bmim］BF4／（NH4）2SO4雙水相體系萃取山楂黃酮、多糖效果良好，后續(xù)將進(jìn)一步考察離子液體的回收和循環(huán)使用方法，以降低成本。

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