水樣發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)試的方式與表征

孫成華，劉 康，衡麗娜，劉保獻(xiàn)

北京環(huán)境保護(hù)監(jiān)測(cè)中心，北京 100048

對(duì)排放物毒性的評(píng)價(jià)和控制的經(jīng)典方法是對(duì)特定化學(xué)物質(zhì)的指標(biāo)監(jiān)測(cè)和限制，如工業(yè)廢水的評(píng)價(jià)和控制主要圍繞綜合指標(biāo)(BOD5、COD、DOC、TN、TP等)和單一的有毒有害指標(biāo)(如典型重金屬、有毒有害的特定有機(jī)物)開(kāi)展，但是這些指標(biāo)的監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)均存在一定的局限性［1］。一方面，實(shí)際的環(huán)境樣品中可能存在很多未知的化合物，對(duì)于綜合性樣品的研究表明，特異性化學(xué)分析測(cè)定未知樣品的毒性?xún)H占毒性檢測(cè)的20%;另一方面，毒性效應(yīng)是所有組成物質(zhì)協(xié)同或拮抗作用的綜合結(jié)果，李專(zhuān)等［13］對(duì)工業(yè)廢水的研究表明，部分企業(yè)排放的化學(xué)指標(biāo)合格的廢水對(duì)生物還具有不同程度的毒性，所以單純化學(xué)物質(zhì)的監(jiān)測(cè)和限定不能為水體的安全提供充分的保障。生物毒性試驗(yàn)應(yīng)用“黑箱”方法，它不是揭示水中含有哪些污染物以及確定污染物濃度，而是綜合反映廢水對(duì)生物毒性的大小及危害程度。目前，許多國(guó)家已應(yīng)用生物學(xué)方法對(duì)排放物毒性進(jìn)行測(cè)定和評(píng)價(jià)，從而最終判定環(huán)境樣品的綜合毒性效應(yīng)。對(duì)環(huán)境樣品進(jìn)行生物毒性測(cè)試是化學(xué)分析的必要補(bǔ)充和延伸。

發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)技術(shù)基于在一定實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度恒定，任何毒性物質(zhì)抑制其正常代謝，都會(huì)導(dǎo)致發(fā)光強(qiáng)度的減弱，毒性越強(qiáng)，對(duì)代謝的抑制作用越強(qiáng)，發(fā)光被抑制得越厲害的原理。該技術(shù)是目前國(guó)際上研究最多的毒性檢測(cè)技術(shù)，有國(guó)際、國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)支持［5-11］。

美國(guó)、加拿大、德國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家早在20世紀(jì)七八十年代就已經(jīng)開(kāi)始實(shí)施廢水綜合毒性控制，并制定了相應(yīng)的毒性控制標(biāo)準(zhǔn)［1］。德國(guó)水管理法(WHG)明確規(guī)定了廢水排放的發(fā)光細(xì)菌毒性限制值，填埋場(chǎng)滲出液、工業(yè)冷卻水、化學(xué)工業(yè)的廢水的稀釋因子(GL) 分別為 4、12、32［1］。2008年起，中國(guó)對(duì)發(fā)酵類(lèi)制藥行業(yè)也開(kāi)始實(shí)施發(fā)光細(xì)菌毒性控制管理，標(biāo)準(zhǔn)限值采用等效氯化汞的質(zhì)量濃度［1］。為了解不同類(lèi)型的環(huán)境樣品對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性狀況，應(yīng)用費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)，依據(jù) ISO 11348-3［10］費(fèi)氏弧菌凍干法，從環(huán)境質(zhì)量樣品及污染源樣品中選取不同類(lèi)型的水樣，開(kāi)展了發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試，探討了不同環(huán)境管理目標(biāo)的樣品急性毒性定量表征方式。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

MicroTox稀釋液，MicroTox滲透壓調(diào)節(jié)液，MicroTox補(bǔ)充液，實(shí)驗(yàn)用小玻璃試管，費(fèi)氏弧菌凍干粉(批號(hào) 12B4022、12K4130A);10 ～100 μL 可調(diào)節(jié)取樣槍?zhuān)?00～1 000 μL可調(diào)節(jié)取樣槍;苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液(標(biāo)準(zhǔn)號(hào) GSB 07—1281-2000，批號(hào)102309)，七水硫酸鋅(分析純);Microtox Model 500毒性檢測(cè)系統(tǒng)，儀器配備了30孔溫控培養(yǎng)室，溫度控制在(15±0.5)℃;恒溫調(diào)節(jié)溫控菌種培養(yǎng)槽，溫度控制在(5.5±1)℃;實(shí)驗(yàn)樣品測(cè)試井，溫度控制在(15±1.0)℃。旋渦混合器、定時(shí)器。

污水處理廠進(jìn)出水、垃圾填埋場(chǎng)周邊地下觀測(cè)井井水、部分工業(yè)企業(yè)生產(chǎn)廢水、地下生活飲用水及地表水源樣品。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)光細(xì)菌復(fù)蘇前準(zhǔn)備

將凍干細(xì)菌容器小瓶從－20℃的冷凍柜中取出，輕輕叩擊瓶壁使凍干菌落入瓶底，回升溫度到4℃左右。在恒溫調(diào)節(jié)溫控(5.5±1)℃菌種培養(yǎng)槽的孔中放置一個(gè)測(cè)試試管，如復(fù)蘇小支菌粉，在管中加入1 mL MicroTox稀釋液，如復(fù)蘇大支菌粉，在管中加入1 mL MicroTox補(bǔ)充液，使其恒溫保持在(5.5±1)℃。

1.2.2 樣品測(cè)試準(zhǔn)備

根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)試管，插入溫控培養(yǎng)室試管井中，A、C、E排試管用于待測(cè)樣品，A1加入1 mL MicroTox稀釋液作為對(duì)照，A2～A5、C1～C5、E1～E5管中加入1 mL待測(cè)樣品和0.1 mL MicroTox滲透壓調(diào)節(jié)液，混勻保持在(15±1)℃。

B、D、F排實(shí)驗(yàn)前每支試管內(nèi)加入0.1 mL復(fù)蘇好的發(fā)光菌懸浮液。

1.2.3 凍干菌粉復(fù)蘇

在回升溫度到4℃左右的菌粉瓶中加入(5.5±1)℃的稀釋液或補(bǔ)充液，小包裝菌粉每支加入0.3～0.4 mL稀釋液，用旋渦混合器振蕩混勻，置于(15±1)℃試管井復(fù)蘇15 min開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，大包裝菌粉每支加入1 mL MicroTox補(bǔ)充液混勻制成發(fā)光細(xì)菌濃縮液，使其恒溫保持在(5.5±1)℃復(fù)蘇5 min，實(shí)驗(yàn)時(shí)取濃縮菌液，按1∶10比例用MicroTox稀釋液稀釋置于(15±1)℃試管井復(fù)蘇15 min開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 樣品測(cè)試

Model 500毒性檢測(cè)系統(tǒng)設(shè)置了不同的操作程序，按照儀器操作程序指示在發(fā)光菌復(fù)蘇15 min后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，先測(cè)試0.1 mL發(fā)光菌初始發(fā)光值，再往每支菌液試管加入0.9 mL已恒溫在(15±1)℃的稀釋液或調(diào)整好滲透壓的樣品溶液，混勻，計(jì)時(shí)，然后測(cè)試發(fā)光強(qiáng)度的變化。樣品毒性初步篩選實(shí)驗(yàn)按照81.9%Screening Test模式，每個(gè)樣品測(cè)試平行雙樣，每批次樣品加空白或毒性參照物做質(zhì)控樣，初篩實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)光抑制率在60%以上的高毒樣品，將樣品按指數(shù)梯度稀釋?zhuān)凑?1.9%Basic Test模式進(jìn)行半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)試驗(yàn)。2個(gè)模式均可同時(shí)測(cè)試樣品與菌種接觸5 min及15 min的發(fā)光抑制情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 毒性測(cè)試質(zhì)量控制

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

依據(jù)美國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)方法要求，選擇了易溶、穩(wěn)定、常見(jiàn)、價(jià)廉、對(duì)人和環(huán)境危害小的苯酚和硫酸鋅為毒性參照物，將苯酚、七水硫酸鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液按指數(shù)梯度稀釋?zhuān)凑?1.9%Basic Test模式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立苯酚濃度或硫酸鋅濃度與發(fā)光抑制率的回歸方程，求出苯酚或硫酸鋅的EC50，苯酚和硫酸鋅的EC50基本符合美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)方法［11］規(guī)定:苯酚為 13～26 mg/L，硫酸鋅為5～12 mg/L。苯酚曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.983 2～0.991 5，硫酸鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.888 9～0.956 0。圖1、圖2分別為苯酚、硫酸鋅的回歸曲線。

圖1 苯酚濃度與發(fā)光抑制率的擬合曲線

圖2 七水硫酸鋅濃度與發(fā)光抑制率的擬合曲線

2.1.2 方法的精密度

控制相同濃度的毒性參照物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以?xún)?nèi)。對(duì)同一低濃度硫酸鋅溶液，5 min發(fā)光抑制率平均值與15 min發(fā)光抑制率平均值差異較大，在測(cè)試水樣綜合毒性尤其是可能由于重金屬污染引起的毒性時(shí)，應(yīng)選擇15 min或更長(zhǎng)的暴露時(shí)間。實(shí)際水樣的急性毒性測(cè)試結(jié)果均按照樣品與菌種接觸15 min的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。

2.1.3 空白值的質(zhì)量控制

為保證測(cè)試結(jié)果有效，排除因菌液質(zhì)量不穩(wěn)定帶來(lái)的誤差，每批次樣品測(cè)試時(shí)要加1～2個(gè)MicroTox稀釋液作空白樣或加一個(gè)毒性參照物作質(zhì)控樣。空白值波動(dòng)曲線見(jiàn)圖3，控制實(shí)驗(yàn)的空白發(fā)光抑制率在－10% ～10%之間［3］。

圖3 空白樣的發(fā)光抑制率波動(dòng)曲線

2.2 在飲用水源監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)試在飲用水源監(jiān)測(cè)的應(yīng)用目標(biāo)是對(duì)突發(fā)污染事故進(jìn)行預(yù)警，一般情況下以發(fā)光抑制率低于20%作為毒性污染的判定值，但自然水體成分復(fù)雜，可能存在適于微生物生長(zhǎng)的元素，會(huì)出現(xiàn)刺激發(fā)光細(xì)菌發(fā)光的情況。在飲用水源監(jiān)測(cè)中，利用大量日常測(cè)試的無(wú)毒樣品的發(fā)光抑制率值為背景值，按照公式 D=μ±3SD(式中μ為監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的平均值，SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差)的統(tǒng)計(jì)方法［4］，計(jì)算出各水源水、地下水的毒性預(yù)警基準(zhǔn)線，能更及時(shí)準(zhǔn)確地判斷飲用水源是否受到毒性污染。圖4為應(yīng)用某地表水源日常監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)繪制的毒性預(yù)警基線圖，樣品發(fā)光抑制率落在－24.3% ～16.5%之間為正常;圖5為應(yīng)用33口井水的測(cè)試值繪制的毒性預(yù)警基線圖，對(duì)于地下水樣品，發(fā)光抑制率落在－33.1% ～－1.9%之間為正常。日常監(jiān)測(cè)的無(wú)毒性基礎(chǔ)數(shù)據(jù)可以隨時(shí)補(bǔ)充代入計(jì)算，數(shù)據(jù)越多，生物毒性預(yù)警的準(zhǔn)確率越高。

圖4 某地表飲用水源發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)試預(yù)警區(qū)間

圖5 地下飲用水發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)試預(yù)警區(qū)間

2.3 在污染源監(jiān)督監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

應(yīng)用發(fā)光細(xì)菌測(cè)試了6家垃圾填埋場(chǎng)周邊34口觀測(cè)井井水的急性毒性，按照發(fā)光抑制率大于20%的毒性經(jīng)驗(yàn)判定值來(lái)統(tǒng)計(jì)，有2個(gè)發(fā)光抑制率大于50%的高毒樣品，有1個(gè)發(fā)光抑制率接近20%的低毒樣品，結(jié)果見(jiàn)圖6。但按照地下水的預(yù)警區(qū)間統(tǒng)計(jì)(圖5)，發(fā)光抑制率低于20%的樣品中有11個(gè)樣本有輕微毒性。同時(shí)測(cè)試了6個(gè)處理后的垃圾滲瀝液樣本，發(fā)光抑制率均為負(fù)值，對(duì)發(fā)光細(xì)菌未產(chǎn)生急性毒性。測(cè)試了一個(gè)未經(jīng)處理的垃圾滲瀝液樣本，發(fā)光抑制率為96.3%，毒性極強(qiáng)。

圖6 2013年垃圾填埋場(chǎng)周邊觀測(cè)井井水發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試結(jié)果

應(yīng)用發(fā)光細(xì)菌測(cè)試了34家城市污水處理廠的處理后出水，除了1家發(fā)光抑制率為4%，其余33家均為負(fù)值;測(cè)試了5家企業(yè)處理設(shè)施出水樣本17個(gè)，其中12個(gè)樣本發(fā)光抑制率均為負(fù)值，表明經(jīng)過(guò)生化處理的出水對(duì)微生物的急性毒性風(fēng)險(xiǎn)很低?，F(xiàn)代廢水處理工藝中都要利用馴化的微生物群落降解有機(jī)物，因此生化處理后的出水如未經(jīng)加氯消毒處理，對(duì)處于同一營(yíng)養(yǎng)層的發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光不會(huì)產(chǎn)生影響。廢水經(jīng)凈化處理，達(dá)到一定的排放標(biāo)準(zhǔn)后，仍可能含有痕量有毒有害污染物［3］，這些物質(zhì)是否存在慢性毒性以及是否對(duì)其他種類(lèi)生物產(chǎn)生毒害作用還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明，因此應(yīng)選用營(yíng)養(yǎng)級(jí)別更高的生物對(duì)生化處理后的出水開(kāi)展毒性測(cè)試，以降低排水對(duì)受納水體生物的影響，從而保證水環(huán)境的生態(tài)安全。

對(duì)21個(gè)不同類(lèi)型的污染源水樣進(jìn)行了發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試，分別為7個(gè)污水處理廠進(jìn)水、1個(gè)機(jī)電企業(yè)生產(chǎn)廢水、1個(gè)防水技術(shù)企業(yè)廢水、1個(gè)化工生產(chǎn)廢水、9個(gè)重金屬相關(guān)企業(yè)廢水、2個(gè)未處理的垃圾填埋場(chǎng)滲瀝液。其中，12個(gè)樣品發(fā)光抑制率大于20%，有57.1%的樣品顯示出對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性效應(yīng)，這期間9個(gè)樣品發(fā)光抑制率在50%以上，毒性很強(qiáng)(圖7)。對(duì)于這些毒性較強(qiáng)的樣品需要進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)確定其毒性大小。發(fā)光抑制率在60%以上的高毒樣品，將樣品按指數(shù)梯度稀釋?zhuān)凑?81.9%Basic Test模式進(jìn)行EC50試驗(yàn);發(fā)光抑制率在60%以下的樣品將發(fā)光抑制率值代入苯酚或硫酸鋅標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計(jì)算相當(dāng)于毒性參照物的當(dāng)量濃度。

圖7 不同類(lèi)型污染源水樣發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試結(jié)果

2008年起，中國(guó)對(duì)發(fā)酵類(lèi)制藥行業(yè)開(kāi)始實(shí)施發(fā)光細(xì)菌毒性控制管理，標(biāo)準(zhǔn)限值采用氯化汞的質(zhì)量濃度，排放限值為氯化汞的質(zhì)量濃度(0.07 mg/L)［1］。選擇1家制藥企業(yè)的廢水進(jìn)行了發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表1。王麗莎等［2］曾經(jīng)應(yīng)用明亮發(fā)光桿菌比較過(guò)鋅離子和氯化汞的毒性，并計(jì)算出兩者之間毒性強(qiáng)度的關(guān)系，氯化汞的毒性是鋅離子毒性的12.5倍。按照這個(gè)系數(shù)可以計(jì)算3個(gè)出水的氯化汞質(zhì)量濃度分別為0.86、0.03、0.02 mg/L。由于這個(gè)系數(shù)是應(yīng)用明亮發(fā)光桿菌測(cè)試得到的，這樣的計(jì)算可能不一定適用于費(fèi)氏弧菌實(shí)驗(yàn)，卻有所啟示:應(yīng)用費(fèi)氏弧菌測(cè)試氯化汞、七水硫酸鋅毒性，建立起兩者毒性強(qiáng)度之間的相關(guān)關(guān)系，就可以使用低毒的硫酸鋅為參照物測(cè)試制藥廢水，同時(shí)避免劇毒的氯化汞危害人體健康和生態(tài)環(huán)境。

表1 制藥企業(yè)出水的發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試結(jié)果

2.4 發(fā)光細(xì)菌毒性定量表征

對(duì)于發(fā)光細(xì)菌急性毒性的定量表征方式，中國(guó)國(guó)標(biāo)測(cè)試方法選用的是等效氯化汞或苯酚的質(zhì)量濃度，國(guó)內(nèi)也有科研人員采用百分?jǐn)?shù)等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)［12］衡量樣品毒性。德國(guó)在生物毒性監(jiān)測(cè)管理中，應(yīng)用GL定量表征生物毒性。在發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試中，將樣品稀釋成系列濃度并測(cè)定每個(gè)稀釋濃度的發(fā)光抑制率，其中造成20%或20%以下發(fā)光抑制率的樣品的稀釋倍數(shù)即為GL，稀釋因子直觀反映了廢水稀釋到什么程度再排放才對(duì)水環(huán)境生物無(wú)不良影響。美國(guó)、加拿大、愛(ài)爾蘭采用EC50來(lái)定量表征發(fā)光細(xì)菌毒性［1］，EC50能清楚地區(qū)分不同樣品的毒性大小，但在水樣毒性小于半數(shù)效應(yīng)的濃度時(shí)難以確定毒性的效應(yīng)水平。表2列出了不同樣品應(yīng)用這些不同的毒性表征方式計(jì)算所得的結(jié)果。

表2 樣品發(fā)光細(xì)菌毒性不同的定量表征結(jié)果

從表2和圖1可以看出，當(dāng)樣品發(fā)光抑制率小于60%時(shí)，用參比物(苯酚)質(zhì)量濃度表示毒性直觀清楚;當(dāng)樣品發(fā)光抑制率大于60%時(shí)，表示等效毒性參比物(苯酚)的曲線趨于平直，說(shuō)明即使不斷增加苯酚濃度，發(fā)光抑制率的變化也不再顯著。這表明，按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的苯酚質(zhì)量濃度已不能準(zhǔn)確表征各樣品之間毒性的實(shí)際差異。

當(dāng)樣品發(fā)光抑制率大于60%時(shí)，將樣品按指數(shù)梯度稀釋?zhuān)瑴y(cè)試各稀釋度樣品的發(fā)光抑制率，繪制樣品稀釋度與發(fā)光抑制率的擬合曲線，依據(jù)曲線計(jì)算EC50或稀釋因子，稀釋因子直觀反映了廢水毒性消失的稀釋倍數(shù)，因此，稀釋因子定量表示高毒樣品的毒性，直觀地反映了環(huán)境樣品對(duì)生物的影響，體現(xiàn)出在工業(yè)廢水毒性管理中良好的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)試在環(huán)境應(yīng)急監(jiān)測(cè)、水源早期生物預(yù)警中，采用繪制毒性預(yù)警基線圖的方式比較可行;在污染源監(jiān)督監(jiān)測(cè)中，對(duì)于發(fā)光抑制率低于60%、無(wú)法求出EC50的樣品，采用等效毒性參照物的質(zhì)量濃度表征廢水的毒性，對(duì)于發(fā)光抑制率高于60%時(shí)，采用稀釋因子表示樣品的毒性更直觀可靠。

城市污水處理廠的出水、經(jīng)過(guò)生化處理后工業(yè)廢水、滲瀝液等，雖然均刺激發(fā)光細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度增加，但僅僅代表生化處理出水對(duì)發(fā)光細(xì)菌沒(méi)有急性毒性。廢水經(jīng)凈化處理后，達(dá)到一定的排放標(biāo)準(zhǔn)，仍可能含有痕量有毒有害污染物，這些物質(zhì)是否存在慢性毒性以及是否對(duì)其他種類(lèi)生物產(chǎn)生毒害作用還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。

應(yīng)用發(fā)光細(xì)菌測(cè)試?yán)盥駡?chǎng)觀測(cè)井、滲瀝液、工業(yè)企業(yè)生產(chǎn)廢水、污水處理廠進(jìn)水等樣品毒性，可以避免或減少?gòu)U水過(guò)高的毒性對(duì)污水處理工程菌的危害，降低處理成本。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)這些樣品生物毒性的監(jiān)督監(jiān)測(cè)，建立起相應(yīng)的毒性監(jiān)督管理標(biāo)準(zhǔn)，從而有效地督促工業(yè)企業(yè)對(duì)廢水處理工藝的改進(jìn)和優(yōu)化，保證工業(yè)廢水安全排放，控制水環(huán)境污染，保護(hù)水資源。

［1］胡洪營(yíng)，吳乾元，楊揚(yáng)，等.面向毒性控制的工業(yè)廢水水質(zhì)安全和評(píng)價(jià)管理辦法［J］.環(huán)境工程技術(shù)學(xué)報(bào)，2011，1(1):46-51.

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