某國產(chǎn)D－二聚體試劑的臨床驗(yàn)證研究

馬艷俠，張建平，穆彥龍（.陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西咸陽 7000 ；.咸陽市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，陜西咸陽 7000）

D－二聚體（D－D）是交聯(lián)纖維蛋白特異性降解產(chǎn)物，是反映凝血和纖溶系統(tǒng)功能的指標(biāo)，主要用于高凝狀態(tài)和繼發(fā)性纖溶亢進(jìn)的診斷［1］。目前還沒有國際約定的D－D參考測量程序和校準(zhǔn)品，商品化檢測試劑采用膠乳凝集法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、膠體金顯色法、膠乳免疫比濁法等方法。每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，靈敏度和特異度也有很大差別。即使采用相同檢測方法的不同廠家試劑，采用的參考測量程序和校準(zhǔn)品溯源性也有所不同，導(dǎo)致其線性范圍、參考區(qū)間存在差異。D－D最常用的檢測方法為膠乳免疫比濁法，以全自動血凝儀進(jìn)行檢測［2］。本研究通過比較國產(chǎn)試劑和進(jìn)口試劑的檢測性能，旨在確定國產(chǎn)試劑的精密度、準(zhǔn)確度，以及建立適用于本地區(qū)人群的參考區(qū)間。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年1～12月于陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院以及陜西省咸陽市中心醫(yī)院就診的患者38例納入患者組，男20例、女18例，年齡18～75歲，包括手術(shù)后9例、產(chǎn)科8例、肝硬化4例、卵巢癌4例、乳腺癌3例、肺栓塞3例、腦血管疾病3例、急性心肌梗死2例、尿毒癥2例。同期體檢健康者162例納入對照組，男84例、女78例，年齡10～70歲，無心、肺、肝、腎等器質(zhì)性疾病，無糖尿病、高血壓、腫瘤等病史，排除妊娠期女性。年齡、性別等一般資料組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑 日本Sysmex公司CA1500全自動血凝儀。國產(chǎn)膠乳免疫比濁法D－D檢測試劑（A試劑）購自國內(nèi)某生物科技有限公司，批號20101019 。進(jìn)口膠乳免疫比濁法D－D檢測試劑（J試劑）及配套校準(zhǔn)品、質(zhì)控品購自日本積水醫(yī)療株式會社，批號分別為819RHH、811RIH、815RHH。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集與檢測 采集所有受試對象晨起空腹靜脈血至含有0.109mol／L枸櫞酸鈉的抗凝管中（枸櫞酸鈉與血液比例為1∶9），30min內(nèi)以3 000 r／min離心10min分離血漿標(biāo)本，2h內(nèi)采用A、J試劑進(jìn)行D－D檢測，檢測方法參照儀器及試劑說明書。以J試劑作為對照試劑。

1.3.2 質(zhì)量控制 采用線性回歸法校準(zhǔn)試劑后進(jìn)行低值及高值質(zhì)控品檢測。在1d之內(nèi)取3瓶質(zhì)控品，采用兩種試劑檢測低值及高值質(zhì)控品各10次，計(jì)算批內(nèi)精密度（以CV%批內(nèi)表示）；連續(xù)10d，每天采用兩種試劑檢測低值、高值質(zhì)控品各1次，計(jì)算批間精密度（以CV%批間表示）。在確認(rèn)質(zhì)控品檢測結(jié)果在控制范圍內(nèi)后進(jìn)行受試對象標(biāo)本檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以表示，偏態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)、四分位間距或百分位數(shù)表示。兩種試劑批內(nèi)、批間精密度數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布且方差齊性，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。兩組受試對象臨床標(biāo)本檢測結(jié)果的差值為非正態(tài)分布，組間比較采用配對設(shè)計(jì)Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)。顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；等效性檢驗(yàn)采用置信區(qū)間推斷法，顯著性水準(zhǔn)α＝0.05，為雙單側(cè)檢驗(yàn)，等效界值δ為J試劑檢測結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差的1／5，等效區(qū)間為－δ～δ，如果兩組總體均數(shù)之差的（1－2α）×100%，即雙側(cè)90%置信區(qū)間（90%CI）位于等效區(qū)間內(nèi)，認(rèn)為兩組試劑等效。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)控品檢測批內(nèi)精密度分析 以A試劑和J試劑分別檢測低值、高值質(zhì)控品各10次，批內(nèi)精密度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.087、0.238），見表1。兩組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布（A試劑W 值分別為0.935、0.944，P值分別為0.504、0.596；J試劑 W 值分別為0.955、0.965，P 值分別為0.732、0.839），且方差齊性（F 值分別為0.003、0.249，P 值分別為0.955、0.624）。

表1 兩種試劑D－D質(zhì)控品檢測批內(nèi)精密度比較

2.2 質(zhì)控品檢測批間精密度分析結(jié)果 以A試劑和J試劑對低值、高值質(zhì)控品進(jìn)行連續(xù)10d的檢測，批間精密度比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 值分別為0.274、0.318），見表2。兩組數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布（A試劑W 值分別為0.902、0.932，P值分別為0.228、0.466；J試劑W 值分別為0.986、0.922，P 值分別為0.990、0.373），且方差齊性（F 值分別為0.592、0.048，P 值分別為0.452、0.829）。

表2 兩種試劑D－D質(zhì)控品檢測批間精密度比較（）

表2 兩種試劑D－D質(zhì)控品檢測批間精密度比較（）

組別 n 低值（，μg／mL）CV%批間（%）高值（，μg／mL）CV%批間（%）10 2 .39±0.11 4.60 8.29±0.16 1.93 J試劑組A試劑組10 2 .46±0.14 5.69 8.37±0.18 2.15

2.3 參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果 以對照組標(biāo)本A試劑檢測結(jié)果進(jìn)行D－D 95%參考區(qū)間驗(yàn)證。數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)性（W＝0.952，P＝0.000），呈右偏態(tài)分布，采用百分位數(shù)法計(jì)算雙側(cè)95%參考區(qū)間，即X2.5%～X97.5%為（0.14～0.97）μg／mL。

2.4 臨床標(biāo)本兩種試劑檢測結(jié)果比較 200例臨床標(biāo)本，A試劑D－D檢測結(jié)果的中位數(shù)、四分位間距分別為0.51、0.50 μg／mL，J試劑D－D檢測結(jié)果中位數(shù)、四分位間距分別為0.53、0.40μg／mL，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z＝－0.517，P＝0.605）。A、J試劑檢測結(jié)果配對差值為非正態(tài)分布（W＝0.583，P＝0.000），中位數(shù)、四分位間距分別為－0.02、0.19 μg／mL。采用配對設(shè)計(jì)Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)。A試劑D－D檢測結(jié)果均值、標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.85、5.43μg／mL，J試劑 D－D檢測結(jié)果均值、標(biāo)準(zhǔn)差分別為1.83、5.22μg／mL，則等效性檢驗(yàn)等效區(qū)間為－1.04～1.04，兩組總體均數(shù)之差的雙側(cè)90%CI為－0.85～0.89，位于等效區(qū)間內(nèi)，可認(rèn)為兩組試劑等效。

3 討 論

膠乳免疫比濁法檢測D－D的原理是以D－D單克隆抗體包被乳膠顆粒，標(biāo)本中的D－D與之產(chǎn)生特異的抗原抗體反應(yīng)，使顆粒凝集而增加反應(yīng)液的濁度，將濁度的變化與校準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，即可獲得標(biāo)本中D－D的定量檢測結(jié)果。膠乳免疫比濁法D－D檢測具有反應(yīng)速度快、定量準(zhǔn)確、敏感度高等特點(diǎn)，并且可以和常規(guī)凝血項(xiàng)目同時檢測，因此廣泛應(yīng)用于自動化血凝儀［3］。

D－D水平反映體內(nèi)凝血－纖溶系統(tǒng)活化狀況，與多種疾病密切相關(guān)，可用于深靜脈血栓、肺栓塞、彌散性血管內(nèi)凝血、血栓疾病的診斷、溶栓療效觀察，在肝炎、心血管疾病、惡性腫瘤等領(lǐng)域也有一定的應(yīng)用價值。受諸多因素的影響（如方法學(xué)、試劑成分等），不同D－D檢測試劑的線性范圍、參考區(qū)間等存在一定的差異［4］。受試者年齡、生理變化、是否妊娠、藥物治療等因素對D－D檢測結(jié)果也存在一定的影響［5］。

本研究采用日本Sysmex公司CA1500型全自動血凝儀對國產(chǎn)D－D檢測試劑的性能進(jìn)行了驗(yàn)證，并建立了適合本地區(qū)的參考區(qū)間。研究結(jié)果顯示，該國產(chǎn)試劑檢測批內(nèi)、批間精密度和日本積水醫(yī)療株式會社D－D檢測試劑比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但關(guān)于該國產(chǎn)試劑的線性范圍、功能靈敏度、臨界值等其他檢測效能指標(biāo)，尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證［6］。

值得注意的是，本次試驗(yàn)納入的162例健康者中，60歲以上人群所占比例不到10%，且未納入妊娠期女性。但有研究顯示，隨著受試者年齡增長，D－D水平有所升高，而妊娠期、月經(jīng)期女性體內(nèi)組織纖溶酶原激活物（t－PA）大量釋放進(jìn)入血循環(huán)，使纖溶酶活性增高，D－D水平也增高［7］。此外，尿激酶、鏈激酶、肝素、避孕藥、雌激素、某些抗高血壓藥物也可導(dǎo)致t－PA活性升高，引起D－D水平的變化［8］。因此，對存在上述特殊情況的人群而言，其D－D檢測結(jié)果應(yīng)給予更為全面的分析，所適用的參考區(qū)間可能也需單獨(dú)建立。尤其是將D－D檢測結(jié)果用于疾病診斷和療效評價時，更應(yīng)建立具有明確臨床意義的臨界值，避免單純應(yīng)用參考區(qū)間進(jìn)行決策［9］。

本研究結(jié)果顯示，該國產(chǎn)試劑與采用相同方法的日本積水醫(yī)療株式會社D－D試劑檢測效能相當(dāng)［10］。本研究采用了等效性檢驗(yàn)的方法，與臨床等效臨界值比較，能夠更為全面地驗(yàn)證其臨床性能［11］。在實(shí)際應(yīng)用中，有研究者將等效性檢驗(yàn)等同于差異性檢驗(yàn)不拒絕零假設(shè)的情形，若差異性檢驗(yàn)為P＞α，則等效性檢驗(yàn)結(jié)論為“等效”的比例隨著標(biāo)本量的增加而增加，當(dāng)標(biāo)本量大于150時，若差異性檢驗(yàn)為P＞α，則等效性檢驗(yàn)結(jié)論為“等效”的比例可達(dá)100%［12］。本研究所納入的標(biāo)本量較大，因此等效性檢驗(yàn)和差異性檢驗(yàn)結(jié)論相符。筆者認(rèn)為在臨床試驗(yàn)研究中，應(yīng)注意上述兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的差異，并同時注意標(biāo)本量的大小。

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