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    基于8-氨基1,3,6-萘三磺酸二鈉鹽的糖基化蛋白質(zhì)標(biāo)記方法

    2014-10-11 05:06:48秦新英李瑞
    關(guān)鍵詞:核糖核酸糖蛋白糖基化

    秦新英,李瑞

    (1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,河北省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北保定 071002;

    2.固廢資源化利用與節(jié)能建材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100041)

    基于8-氨基1,3,6-萘三磺酸二鈉鹽的糖基化蛋白質(zhì)標(biāo)記方法

    秦新英1,李瑞2

    (1.河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,河北省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北保定 071002;

    2.固廢資源化利用與節(jié)能建材國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100041)

    發(fā)展了基于熒光試劑8-氨基1,3,6-萘三磺酸二鈉鹽(ANTS)的糖基化蛋白質(zhì)選擇性標(biāo)記和熒光檢測(cè)的新方法.實(shí)驗(yàn)中以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)細(xì)胞色素c和核糖核酸酶b為樣品,優(yōu)化了pH和反應(yīng)時(shí)間.在優(yōu)化的條件下,核糖核酸酶b的檢測(cè)靈敏度可提高22倍,而非特異性的標(biāo)記僅為1%,顯示了這種衍生方法極好的選擇性.進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于卵清蛋白的衍生,通過(guò)結(jié)合二氧化鈦(TiO2)親和富集,共鑒定到14個(gè)蛋白質(zhì),其中超過(guò)85%的蛋白質(zhì)具有一致的N-X-T/S(X為除脯氨酸以外的其他氨基酸)序列,為潛在的糖基化蛋白,進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的高選擇性.

    8-氨基1,3,6-萘三磺酸二鈉鹽;糖基化蛋白質(zhì);標(biāo)記;熒光檢測(cè)

    糖基化蛋白質(zhì)是一種重要的翻譯后修飾蛋白質(zhì),在生命體中發(fā)揮著重要的作用.糖基化蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化與多種癌癥的發(fā)生息息相關(guān),使得許多種糖基化蛋白質(zhì)成為癌癥診斷和治療的重要靶點(diǎn)[1-3].因此,實(shí)現(xiàn)有效和靈敏的糖基化蛋白質(zhì)檢測(cè)具有重要的意義.

    熒光檢測(cè)是目前最為靈敏的檢測(cè)方式之一,廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)中的諸多領(lǐng)域,實(shí)現(xiàn)了改進(jìn)的生物分子檢測(cè)效率[4].例如,Qiao[5]等將水溶性的磺酸-3-氫-吲哚菁染料sb-cy3-NHS應(yīng)用于蛋白質(zhì)的衍生和熒光檢測(cè),牛血清白蛋白的檢測(cè)限可降低到12.8nmol/L,與采用常用的熒光試劑苯異硫氰酸酯衍生后的檢測(cè)限相比可降低約100倍,顯著地提高了蛋白質(zhì)的檢測(cè)靈敏度.在糖基化蛋白質(zhì)研究中,熒光衍生技術(shù)多用于糖基化蛋白中釋放的寡糖的衍生和檢測(cè)[6],而糖基化蛋白質(zhì)的選擇性衍生和檢測(cè)的技術(shù)尚未見(jiàn)報(bào)道.

    8-氨基-1,3,6-萘三磺酸二鈉鹽(ANTS)是經(jīng)典的多糖熒光標(biāo)記試劑[7],本文初步嘗試將ANTS應(yīng)用于糖基化蛋白質(zhì)的衍生,通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件,實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜樣品中糖基化蛋白質(zhì)的選擇性衍生和靈敏的熒光檢測(cè).該方法有望為后續(xù)深入的糖基化蛋白質(zhì)研究提供新途徑.

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 材料與試劑

    ANTS、細(xì)胞色素c、核糖核酸酶b、伴清蛋白均購(gòu)自于Sigma(St.Louis,MO,USA).TiO2購(gòu)自GL(Tokyo,Japan).三氟乙酸(TFA)和氰基硼氫化鈉(NaCNBH3)均購(gòu)于Acros Organics(Geel,Belgium).高碘酸鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán).色譜純乙腈(ACN)購(gòu)自Merck(Darmstadt,Germany).所有無(wú)機(jī)試劑均為分析純,而其他試劑均為色譜純.實(shí)驗(yàn)中用水采用Milli-Q系統(tǒng)(Millipore,Bedford,USA)純化制得.

    1.2 蛋白質(zhì)衍生

    代表性的蛋白質(zhì)衍生過(guò)程如圖1所示.具體如下,取10μL 50mg/mL卵清蛋白(溶解于100mmol/L乙酸-乙酸鈉,150mmol/L氯化鈉,pH 5.0),加入5μL 40mol/L高碘酸鈉(溶解于100mol/L乙酸-乙酸鈉,150mmol/L氯化鈉,pH 5.0),于25℃避光振蕩反應(yīng)30min,然后加入10μL 80mmol/L亞硫酸鈉(溶解于100mmol/L乙酸-乙酸鈉,150mmol/L氯化鈉,pH 5.0),繼續(xù)于25℃反應(yīng)10min,從而消除過(guò)量的高碘酸鈉.再加入50μL 0.5mg/50μL ANTS(溶解于100mmol/L 乙酸-乙酸鈉,pH 6.0),混勻后加入10μL新鮮配制的1.0mol/L NaCNBH3(溶解于二甲亞砜),25℃反應(yīng)2h,從而實(shí)現(xiàn)糖基化蛋白質(zhì)的標(biāo)記.反應(yīng)完畢,待進(jìn)樣分析.

    1.3 HPLC分析

    HPLC測(cè)定在包含進(jìn)樣閥(Rheodyne,Cotati,CA,USA)、配備四元梯度單元的智能色譜泵(Jasco,Tokyo,Japan)、智能熒光檢測(cè)器(Jasco,Tokyo,Japan)和紫外檢測(cè)器(大連依利特分析儀器有限公司)組成的色譜系統(tǒng)中進(jìn)行,色譜柱為C8柱(250×4.6mm,5μm,30nm).流動(dòng)相A為純水(含體積分?jǐn)?shù)0.1% TFA),流動(dòng)相B為95%的ACN(含0.1%TFA).熒光檢測(cè)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為360nm和515nm,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm.單個(gè)蛋白質(zhì)分析梯度如下:0~30min,10%~70%B;流速:1mL/min.蛋白質(zhì)混合物分離梯度:0~35min,10%~80%B;35~40min,80%~80%B;流速:1mL/min.卵清蛋白質(zhì)分離梯度:0~60min,10%~80%B;60~80min,80%~80%B;流速,0.5mL/min.

    圖1 糖基化蛋白質(zhì)衍生示意Fig.1 Schematic diagram of glycoprotein derivatization

    2 結(jié)果與討論

    2.1 pH對(duì)衍生反應(yīng)的影響

    實(shí)驗(yàn)中選擇了2個(gè)代表性的蛋白:核糖核酸酶b和細(xì)胞色素c.核糖核酸酶b是典型的糖蛋白,而細(xì)胞色素c是典型的非糖蛋白.實(shí)驗(yàn)中以二者質(zhì)量濃度比為1∶1的蛋白混合物考察了反應(yīng)pH對(duì)衍生化的影響.共考察了7個(gè)pH,分別是4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0和10.0的緩沖體系.圖2為核糖核酸酶b的相對(duì)峰面積以及細(xì)胞色素c和核糖核酸酶b的峰面積比隨衍生反應(yīng)pH變化趨勢(shì)圖,當(dāng)衍生體系的pH為6.0時(shí),細(xì)胞色素c與核糖核酸酶b的面積比值為最小,說(shuō)明此時(shí)副反應(yīng)系數(shù)最小,二者的比值為0.114,可以更好地實(shí)現(xiàn)對(duì)糖蛋白的衍生;從圖2中還可以看出,體系的pH越小,糖蛋白的衍生效果越好,但是pH太低時(shí),會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解性,因此最終選擇pH為6.0.

    圖2 pH對(duì)核糖核酸酶b和細(xì)胞色素c的衍生效果的影響Fig.2 Effect of pH of buffer on the derivatization of ribonuclease b and cytochrome c

    2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生反應(yīng)的影響

    進(jìn)一步考察了衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)衍生效果的影響,核糖核酸酶b的相對(duì)峰面積以及細(xì)胞色素c和核糖核酸酶b的峰面積比隨衍生反應(yīng)時(shí)間的變化趨勢(shì)如圖3所示.隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,核糖核酸酶b的峰面積逐漸增加,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)2h后,峰面積趨于穩(wěn)定;細(xì)胞色素c和核糖核酸酶b峰面積比在反應(yīng)時(shí)間1min時(shí)最大,以后顯著降低,并隨著衍生反應(yīng)時(shí)間的增加副反應(yīng)逐漸增加.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2h時(shí),核糖核酸酶b的峰面積達(dá)到最大峰面積的96%,并且在此時(shí)細(xì)胞色素c和核糖核酸酶b的峰面積比值較小且趨于穩(wěn)定,僅為3.6%,因此反應(yīng)時(shí)間最終選擇為2h.

    2.3 單個(gè)糖蛋白質(zhì)衍生

    在優(yōu)化的衍生條件下,以典型的糖蛋白核糖核酸酶b為模式蛋白,考察了熒光試劑ANTS的衍生效果.由于熒光試劑ANTS只與糖蛋白糖鏈氧化后形成的醛基反應(yīng),因此在衍生過(guò)程中若去掉氧化步驟,便可檢測(cè)吸附等非特異性標(biāo)記.因此實(shí)驗(yàn)中比較了0.22mg/mL核糖核酸酶b進(jìn)樣10μL在3種情況下的色譜分離結(jié)果:第一,糖鏈氧化,熒光試劑ANTS標(biāo)記,熒光檢測(cè),如圖4a;第二,糖鏈不氧化,加入ANTS做空白實(shí)驗(yàn),熒光檢測(cè),如圖4b;第三,直接進(jìn)樣分析,紫外檢測(cè),如圖4c.由圖可知,對(duì)于單個(gè)核糖核酸酶b來(lái)說(shuō),通過(guò)選擇性糖鏈標(biāo)記,其檢測(cè)靈敏度與紫外檢測(cè)相比提高了22倍,而非特異性的標(biāo)記僅占了1%,顯示了這種衍生方法極好的選擇性.

    圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)核糖核酸酶b和細(xì)胞色素c衍生效果的影響Fig.3 Effect of reaction time on the derivatization of ribonuclease b and cytochrome c

    圖4 核糖核酸酶b經(jīng)ANTS標(biāo)記熒光檢測(cè)a、熒光空白實(shí)驗(yàn)b和紫外檢測(cè)c的色譜Fig.4 Chromatograms of ANTS labeled ribonuclease b with fluorescent detection a,fluorescence blank b,and UV-visible blank c

    2.4 衍生蛋白質(zhì)混合物

    筆者進(jìn)一步將ANTS應(yīng)用于了蛋白質(zhì)混合物的衍生.共選擇3個(gè)蛋白質(zhì),其中包括2個(gè)糖蛋白:核糖核酸酶b和伴清蛋白;1個(gè)非糖蛋白:細(xì)胞色素c.熒光試劑ANTS只能選擇性與糖蛋白質(zhì)中多糖氧化后形成的醛基反應(yīng),因此理論上,通過(guò)ANTS標(biāo)記和熒光檢測(cè)應(yīng)該僅有2個(gè)色譜峰(分別代表糖核酸酶b和伴清蛋白)實(shí)現(xiàn)有效識(shí)別.如圖5a所示,只有核糖核酸酶b和伴清蛋白在熒光下得到了檢測(cè);而細(xì)胞色素c為非糖蛋白不可能在熒光檢測(cè)下有響應(yīng)信號(hào),進(jìn)一步說(shuō)明了筆者發(fā)展的方法具有很好的選擇性.

    2.5 選擇性卵清蛋白衍生

    進(jìn)一步將該方法應(yīng)用于卵清蛋白提取產(chǎn)物的分析.如圖6所示,經(jīng)過(guò)ANTS標(biāo)記后,熒光檢測(cè)和紫外對(duì)照相比選擇性有很大的差異,其中熒光檢測(cè)靈敏的色譜峰筆者認(rèn)為是糖蛋白.為了進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),將衍生的蛋白質(zhì)混合物用TiO2進(jìn)行捕集,并采用微柱液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行了鑒定,共鑒定到14個(gè)蛋白質(zhì),其中,53%的蛋白質(zhì)是已知的糖基化蛋白質(zhì),而超過(guò)85%的蛋白質(zhì)具有一致的N-X-T/S(X為除脯氨酸以外的氨基酸)序列,因此它們是潛在的糖基化蛋白.以上結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了方法的高選擇性.

    圖5 ANTS標(biāo)記3種蛋白質(zhì)混合物熒光檢測(cè)a和紫外檢測(cè)b色譜.Fig.5 Chromatograms of ANTS labeled 3-protein mixture with fluorescent detection a,and UV-visible blank b

    圖6 ANTS標(biāo)記卵清蛋白熒光檢測(cè)a和紫外檢測(cè)對(duì)照b色譜Fig.6 Chromatograms of ANTS labeled egg white proteins with fluorescent detection a and UV-visible control b

    3 結(jié)論

    發(fā)展了一種選擇性糖基化蛋白質(zhì)衍生和熒光檢測(cè)的新方法.糖基化蛋白質(zhì)多糖經(jīng)氧化后形成的醛基在NaCNBH3存在條件下便可選擇性與熒光試劑ANTS結(jié)合,實(shí)現(xiàn)選擇性的糖蛋白標(biāo)記和熒光檢測(cè).在優(yōu)化的衍生條件下,將該方法應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物和卵清蛋白的衍生,實(shí)現(xiàn)了高選擇性的糖基化蛋白質(zhì)衍生,有望在糖基化蛋白質(zhì)選擇性識(shí)別領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用.

    [1] CHEN Songming,LAROCHE T,HAMELINCK D,et al.Multiplexed analysis of glycan variation on native proteins captured by antibody microarrays[J].Nature Methods,2007,4(5):437-444.

    [2] DENNIS J W,NABI I R,DEMETRIOU M.Metabolism,cell surface organization,and disease[J].Cell,2009,139(7):1229-1241.

    [3] ZHANG Wei,WANG Hong,TANG Hailin,et al.Endoglycosidase-mediated incorporation of18O into glycans for relative glycan quantitation[J].Analytical Chemistry,2011,83(12):4975-4981.

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    (責(zé)任編輯:梁俊紅)

    Research on 8-aminonaphthalene 1,3,6-trisulfonic acid disodium salt based fluorescent tag for selective glycoprotein labeling

    QIN Xinying1,LI Rui2
    (1.Chemical Biology Key Laboratory of Hebei Province,College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China;2.State Key Laboratory of Solid Waste Reuse for Building Materials,Beijing 100041,China)

    The selective glycoprotein labeling method based on fluorescent tag 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid disodium(ANTS)was developed in the present work.With proteins cytochrome c and ribonuclease b as the samples,the pH value and reaction time were optimized.The fluorescent detection sensitivity of glycoprotein ribonuclease b could be increased about 22-fold via ANTS labeling while the nonspecific labeling only 1%,indicating the good selectivity of the developed method.The method was further used for derivatization of egg white proteins.By combining with titanium dioxide(TiO2)for glycoproteins enrichment,totally 14proteins were identified,of which 85%proteins were recognized with the sequence N-X-T/S(X except Pro),as the potential glycoproteins,which further indicated the high selectivity of the developed method.All these results suggested the potential merits of the developed method for high specific glycoprotein recognition.

    book=34,ebook=55

    8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid disodium;glycoprotein;labeling;fluorescent detection

    秦新英(1978-),男,河北邯鄲人,河北大學(xué)副教授,主要從事分析化學(xué)研究.E-mail:hbuqinxinying@163.com

    O658

    A

    1000 -1565(2014)05 -0497 -05

    10.3969/j.issn.1000 -1565.2014.05.010

    2014 -05 -20

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21205027);河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(B2012201052);河北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展項(xiàng)目(QN2014066)

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