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    索拉菲尼對肝星狀細胞活性及活化的影響*

    2014-10-08 09:06:00耿智敏徐之超李文智鄭見寶
    鄭州大學學報(醫(yī)學版) 2014年4期
    關(guān)鍵詞:拉菲培養(yǎng)液單抗

    王 林,李 波,耿智敏#,徐之超,陳 晨,李文智,鄭見寶

    1)西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽外科 西安 710061 2)西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院普通外科 西安 710061

    肝纖維化系指肝組織內(nèi)細胞外基質(zhì)(extracellualr matrix,ECM)過度增生與異常沉積,最終導致肝臟結(jié)構(gòu)和功能異常的病理變化,進而發(fā)展為肝硬變[1]。肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),抑制HSC活化、增殖成為目前阻斷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化的重要策略。索拉菲尼作為一種多靶點、多激酶抑制劑靶向治療藥物,能明顯抑制HCC細胞增殖及血管新生[2],但其對 HSC有無作用,此方面研究較少。該研究通過體外實驗觀察索拉菲尼對HSC活性及活化狀態(tài)的影響,為索拉菲尼治療肝纖維化提供新的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細胞與試劑 人HSC細胞系(LX2)購自中南大學湘雅中心實驗室;索拉菲尼由拜耳公司饋贈,劑型200 mg/片,用體積分數(shù)100%DMSO溶解,-20℃保存。α-SMA兔抗人單抗購自美國Abcam公司,β-actin兔抗人單抗購自北京博奧森公司,ERK1/2兔抗人單抗、p-ERK1/2兔抗人單抗、AKT羊抗人單抗、p-AKT羊抗人單抗、兔抗羊二抗、羊抗兔二抗等購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。TGF-β1和PDGF-BB ELISA檢測試劑盒購自美國R&D公司。

    1.2 細胞培養(yǎng) LX2細胞在37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)基為含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM,取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

    1.3 MTT法測定索拉菲尼對LX2細胞的增殖抑制率 取LX2細胞,以5×104孔-1的密度接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后加入索拉菲尼,藥物濃度分別為0(對照)、1、2、5、10、20、50 μmol/L,每種濃度設(shè) 3個復孔。加藥后分別培養(yǎng)12、24、36、48 h,然后每孔加MTT(5 g/L)20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸去原培養(yǎng)液,加入 DMSO 150 μL/孔,振蕩 10 min,用酶標儀(波長490 nm)測定每孔的A值,增殖抑制率=(對照組A值-實驗組A值)/對照組A值×100%。

    1.4 免疫細胞化學法檢測LX2細胞α-SMA的表達 ①細胞爬片:取LX2細胞,制成細胞懸液,調(diào)整細胞密度為(1~5)×105mL-1。移液器吸取細胞懸液500 μL,分別接種于5組蓋玻片上。培養(yǎng)箱孵育4 h,移液器輕輕移去培養(yǎng)液,對照組加1 mL培養(yǎng)液,實驗組分別加入1 mL 含1、2、5、10 μmol/L 索拉菲尼的培養(yǎng)液,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。②免疫細胞化學染色:40 g/L多聚甲醛固定30 min,PBS洗3遍,體積分數(shù)3%H2O2封閉10 min,PBS洗3遍,山羊血清封閉(室溫下1 h),甩去山羊血清,加入α-SMA一抗,4℃冰箱過夜。PBS洗3遍,加ABC復合物,室溫下30 min~1 h,DAB顯色,蘇木素復染,自來水沖洗,自然風干后,中性樹膠封固。顯微鏡下觀察α-SMA表達情況,并于400倍鏡下選取6個視野進行計分。陽性細胞百分比計分:按照陽性細胞占所有細胞的比例計分,0、<25%、25% ~、50% ~、75% ~分別為0、1、2、3、4 分。著色強度計分:細胞無著色,0分;淺黃色,1分;棕黃色,2分;棕褐色,3分。2項評分結(jié)果相加,0分為陰性(-),1~分為弱陽性(+),4~分為中等陽性(?),6~7分為強陽性(?)。各組分別設(shè)置4個復孔。

    1.5 ELISA 法檢測 TGF-β1和 PDGF-BB 實驗組使用含1、2、5、10 μmol/L 索拉菲尼的培養(yǎng)液,對照組用未加索拉菲尼的單純培養(yǎng)液。分別干預LX2細胞12、24、36 h后,提取上清,使用 ELISA試劑盒檢測上清中TGF-β1和PDGF-BB的水平。各組分別設(shè)置5個復孔。

    1.6 Western blot檢測 AKT/p-AKT 和 ERK1、ERK2/p-ERK1、p-ERK2取LX2細胞,培養(yǎng)液分別為未添加索拉菲尼和含索拉菲尼1、2、5、10 μmol/L的培養(yǎng)液。培養(yǎng)0.5 h后,倒棄培養(yǎng)液,添加400 μL裂解液,置于冰盒上1 h,離心提取蛋白,蛋白定量后上樣20 μL,行Western blot檢測各組不同蛋白表達情況。實驗內(nèi)參為β-actin。每組重復3次。

    1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0進行數(shù)據(jù)分析。采用析因設(shè)計的方差分析比較各組LX2細胞增殖抑制率、上清 TGF-β1和PDGF-BB水平的差異,各組α-SMA表達情況的比較采用Kruskual-Wallis多組等級資料的秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。

    2 結(jié)果

    2.1 索拉菲尼對LX2細胞增殖能力的影響 結(jié)果見表1。

    2.2 免疫細胞化學染色法檢測LX2細胞α-SMA的表達 對照組均有α-SMA表達,1、2、5 μmol/L實驗組均有α-SMA表達,但10 μmol/L組幾乎無正常形態(tài)細胞,α-SMA表達也明顯減弱。見圖1和表2。

    2.3 ELISA 法檢測 TGF-β1與 PDGF-BB 結(jié)果見表 3、4。

    表1 各組LX2細胞的增殖抑制率比較(n=3) %

    圖1 索拉菲尼作用24 h后LX2細胞α-SMA表達情況(SABC,×100)

    表2 各組LX2細胞α-SMA表達情況(n=24)視野

    表3 各組上清TGF-β1水平(n=5) μg/L

    表4 各組上清PDGF-BB水平(n=5) ng/L

    2.4 Western blot檢測結(jié)果 見圖2??芍?,各組ERK1、ERK2、AKT 蛋白表達量基本相同,10 μmol/L組 p-AKT、p-ERK1、p-ERK2蛋白表達降低。

    圖2 各組AKT/p-AKT和ERK1、ERK2/p-ERK1、p-ERK2蛋白表達情況

    3 討論

    索拉菲尼屬于分子靶向治療新藥,是一種多靶點、多激酶抑制劑,在抑制肝癌細胞方面已取得重大進展。其作用機制主要為2個方面[2-3]:①通過阻斷MAPK通路抑制腫瘤細胞增殖。②通過阻斷VEGF受體和PDGF受體,抑制腫瘤血管生成。近年來研究[4-5]發(fā)現(xiàn),索拉菲尼除了可抑制上皮癌細胞的增殖外,還可調(diào)節(jié)鄰近間質(zhì)細胞的受體酪氨酸激酶信號通路。

    活化的HSC是肝纖維化發(fā)生時ECM的主要來源[6]。已有研究[7]表明,索拉菲尼用于門靜脈高壓癥可顯著改善血流動力學、抑制新生血管形成、減輕肝臟的纖維化,明顯降低門靜脈壓力。索拉菲尼是否可以抑制HSC的活性及活化,繼而阻斷、逆轉(zhuǎn)肝纖維化,該實驗對此進行了研究。

    實驗發(fā)現(xiàn),索拉菲尼可抑制LX2細胞活性,還發(fā)現(xiàn)藥物濃度越高索拉菲尼的抑制作用越明顯,且隨著時間的延長索拉菲尼的抑制作用表現(xiàn)得也越明顯。但在48 h時,LX2細胞活性有所恢復,考慮與索拉菲尼藥代動力學因素有關(guān)。故隨后實驗作者選用的藥物濃度為 1、2、5 和 10 μmol/L,作用時間為12、24 和36 h。

    實驗中以不同濃度索拉菲尼干預LX2細胞12、24和36 h后,發(fā)現(xiàn)其作用機制表現(xiàn)為以下幾方面:①索拉菲尼抑制LX2細胞的活化,而α-SMA的表達為HSC活化的標志,活化的HSC是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。免疫細胞化學法檢測α-SMA的表達時發(fā)現(xiàn),對照組和實驗組中α-SMA的表達有差異,證明索拉菲尼可抑制LX2細胞活化。②索拉菲尼可抑制LX2細胞分泌某些細胞活性因子,包括PDGF-BB和TGF-β1。細胞因子分泌作為HSC活化重要特征之一,主要表現(xiàn)在TGF-β1、PDGF-BB等大量分泌。該實驗通過ELISA法檢測不同水平索拉菲尼干預下提取的LX2細胞上清中PDGF-BB、TGF-β1的表達量發(fā)現(xiàn),隨著藥物水平的升高,PDGF-BB和TGF-β1在上清中的水平呈遞減趨勢,而同一藥物水平下,隨著時間的延長,PDGF-BB和TGF-β1也呈遞減表達,進而達到抑制LX2細胞活化的目的。③索拉菲尼通過抑制LX2細胞的PDGF信號通路,從而抑制其活化。該實驗通過Western blot方法檢測Ras/ERK通路中ERK1/ERK2和p-ERK1/p-ERK2以及PI3K通路中AKT和p-AKT的變化,可評估索拉菲尼對PDGF信號通路的影響。作者發(fā)現(xiàn)對照組和實驗組ERK1/ERK2及AKT表達水平基本相同,而其相應(yīng)的磷酸化狀態(tài),實驗組表達逐漸減弱,說明索拉菲尼可抑制PDGF信號通路中ERK1/ERK2及AKT的磷酸化,阻斷了PDGF細胞通路的正常傳導,從而抑制LX2細胞的活化、增殖。

    綜上,該研究初步證實索拉菲尼可下調(diào)HSC上清液中PDGF-BB和TGF-β1的分泌,抑制 PDGF信號通路,最終抑制HSC的活化及活性,為索拉菲尼治療肝纖維化提供了新的理論依據(jù)。

    [1]Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J].Gastroenterology,2008,134(6):1655

    [2]Wilhelm SM,Adnane L,Newell P,et al.Preclinical overview of sorafenib,a multikinase inhibitor that targets both Raf and VEGF and PDGF receptor tyrosine kinase signaling[J].Mol Cancer Ther,2008,7(10):3129

    [3]Liu L,Cao Y,Chen C,et al.Sorafenib blocks the RAF/MEK/ERK pathway,inhibits tumor angiogenesis,and induces tumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5[J].Cancer Res,2006,66(24):11851

    [4]Martinelli E,Troiani T,Morgillo F,et al.Synergistic antitumor activity of sorafenib in combination with epidermal growth factor receptor inhibitors in colorectal and lung cancer cells[J].Clin Cancer Res,2010,16(20):4990

    [5]Wilhelm S,Carter C,Lynch M,et al.Discovery and development of sorafenib:a multikinase inhibitor for treating cancer[J].Nat Rev Drug Discov,2006,5(10):835

    [6]紀輝,遲寶榮,張一寧.肝纖維化與肝星狀細胞[J].吉林大學學報:醫(yī)學版,2008,34(3):538

    [7]朱云,程旸,李愛民,等.索拉菲尼對門靜脈高壓癥的治療作用及其機制[J].南方醫(yī)科大學學報,2014,34(1):133

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