美國SL-9甘薯莖尖脫毒組織培養(yǎng)的最適激素濃度配比初探

戴 力，聶明建，劉少茹

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128）

莖尖脫毒組織培養(yǎng)是甘薯獲得無毒種苗的重要方法。由于不同基因型的甘薯品種所適用的培養(yǎng)基激素濃度配比不同，因此適宜培養(yǎng)基特別是誘導(dǎo)愈傷組織和芽的培養(yǎng)基的篩選便成莖尖脫毒組培技術(shù)的關(guān)鍵。試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，以高淀粉型甘薯品種美國SL-9 的莖尖為材料，對其莖尖脫毒組培培養(yǎng)基的最適激素濃度配比進(jìn)行了探索，篩選出了適合該品種且經(jīng)濟(jì)有效的培養(yǎng)基激素含量配方，以期加快甘薯莖尖脫毒組培技術(shù)的推廣應(yīng)用，推動優(yōu)良品種的生產(chǎn)與開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高淀粉型甘薯品種美國SL-9，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘薯研究所提供。薯塊經(jīng)恒溫培養(yǎng)箱沙培后取莖尖為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以MS 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，對6-BA 和α-NAA 兩種植物激素進(jìn)行不同濃度的配比，通過愈傷組織誘導(dǎo)率（%）、平均苗高（或芽長）（mm）和出芽（成苗）率（%）等指標(biāo)考查甘薯莖尖組織的培養(yǎng)效果。其中，6-BA的濃度水平為：0.10、0.50、1.00 和1.50 mg/L；α-NAA 的濃度水平為：0.10、0.25、0.50 和1.00 mg/L；兩者相互組合得到16個(gè)激素配比處理，詳見表1。每個(gè)處理重復(fù)8 次，每次接種1個(gè)外植體。

1.3 評價(jià)指標(biāo)

通常，在進(jìn)行培養(yǎng)基中激素濃度和種類篩選試驗(yàn)時(shí)，都是直接以愈傷組織誘導(dǎo)率和成苗率或叢芽、胚狀體誘導(dǎo)率的高低來衡量激素配比的好壞[1-2]，誘導(dǎo)率公式如下：

然而，在實(shí)際操作中，由于受到外植體褐變或感染等非激素因素的影響，單獨(dú)以愈傷組織誘導(dǎo)率或成苗率均較難準(zhǔn)確地反映出不同植物激素濃度配比的差異。因此，試驗(yàn)又引進(jìn)了平均芽長（苗高）這一評價(jià)指標(biāo)。以下為較精細(xì)的計(jì)算公式：

1.4 數(shù)據(jù)處理

同時(shí)，為了準(zhǔn)確地表現(xiàn)出培養(yǎng)基激素濃度配比與培養(yǎng)效果的關(guān)系，試驗(yàn)通過線性綜合評價(jià)模型——公式（5），對上述三項(xiàng)評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)，篩選出組培效果最好的激素濃度配比[3]。

式中，xij為第i個(gè)評價(jià)對象的第j 項(xiàng)指標(biāo)值，ωi為評價(jià)指標(biāo)xi 的權(quán)重系數(shù)（ωi≥0，=1），yi 為第i（i=1，2，3，…，n）個(gè)被評價(jià)對象的綜合評價(jià)值。

試驗(yàn)中，根據(jù)專家的經(jīng)驗(yàn)分別將三個(gè)評價(jià)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)設(shè)置為：愈傷組織誘導(dǎo)率（L）0.20；出芽（成苗）率（M）0.35；平均芽長（苗高）（N）0.45。因此，綜合評價(jià)值計(jì)算公式延伸如下：

然后根據(jù)yi的大小進(jìn)行排序，綜合評價(jià)值越大則激素濃度配比越好。

在利用上述模型時(shí)，使用均值化法對各項(xiàng)指標(biāo)值進(jìn)行無量綱化（標(biāo)準(zhǔn)化）處理。

試驗(yàn)使用excel 2003 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 試驗(yàn)步驟

1.5.1 薯塊發(fā)芽 選擇健康的薯塊，以河沙（經(jīng)高錳酸鉀消毒）為介質(zhì)，置于恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)催芽5～7 d，溫度為25℃，相對濕度保持在85%左右。待芽長出5～6 葉時(shí)，就可以剪取莖尖進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)。

1.5.2 外植體的消毒與接種 剪取1～2 cm 長的莖尖去葉，先用蒸餾水沖洗3 次，將沖洗干凈的外植體轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中，用70%酒精處理10 s，然后用2%的次氯酸鈉滅菌5 min，再后用無菌水沖洗4～5 次。在無菌條件下，直接切取含1～2個(gè)葉原基、長1.0～2.0 mm、寬0.5～1.0 mm 的莖尖接種到添加不同濃度植物激素的MS 固體培養(yǎng)基（pH 值5.8～6.0）上。

1.5.3 外植體培養(yǎng) 使用恒溫光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，白天，2 000 Lx 光照16 h，溫度為25℃；晚上，黑暗8 h，溫度為22℃；相對濕度為80%～85%；定期噴灑70%～75%的酒精進(jìn)行消毒，以減少培養(yǎng)過程中的感染。培養(yǎng)到第40 天統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率、出芽（成苗）率以及芽長（或苗高）等指標(biāo)，然后將長出的甘薯苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。

說明：由于培養(yǎng)40 d 后，除少數(shù)處理的不定芽長達(dá)到組培通常使用的成苗標(biāo)準(zhǔn)（>1cm） 外，大多數(shù)愈傷組織的不定芽長度都低于此標(biāo)準(zhǔn)。因此，試驗(yàn)所使用的苗高（芽長） 觀測標(biāo)準(zhǔn)與通常所用的標(biāo)準(zhǔn)所不同：高度h≥10mm 的為苗，而h＜10mm 的為芽。另外，由于測量時(shí)小芽或幼苗仍在試管中（測量后還需繼續(xù)培養(yǎng)），無法測得其準(zhǔn)確高度，因此本試驗(yàn)便采用五等法對幼苗大小進(jìn)行觀察記錄：只有愈傷而看不到芽時(shí)記為0；0＜h≤3 mm 的記為3 mm，3 mm＜h≤5 mm 的記為5 mm，5 mm＜h≤7 mm 的記為7 mm；7 mm＜h≤9 mm 的記為9 mm，以后1.0、1.3、1.5、1.7、1.9 mm 依此類推。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度配比對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

由表1 可知，在16 中培養(yǎng)基配方中，愈傷組織誘導(dǎo)率排在前三位的分別是5 號（0.10 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L α-NAA）、13 號（0.10 mg/L 6-BA＋1.00 mg/L α-NAA）和3 號（1.00 mg/L 6-BA＋0.10 mg/L α-NAA）培養(yǎng)基，除1 號（0.10 mg/L 6-BA＋0.10 mg/L α-NAA）培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率低于40%以外，其它培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率均≥50%。

2.2 不同激素濃度配比對出芽（成苗）率的影響

在16 中培養(yǎng)基配方中，出芽（成苗）率以4 號（1.50 mg/L 6-BA＋0.10 mg/L α-NAA）和11 號（1.00 mg/L 6-BA＋0.50 mg/L α-NAA）培養(yǎng)基最高，其次是7 號（1.00 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L α-NAA）、10 號（0.50 mg/L 6-BA＋0.50 mg/L α-NAA）和15 號（1.00 mg/L 6-BA＋1.00 mg/L α-NAA）培養(yǎng)基，第三為6 號（0.50 mg/L 6-BA＋0.25 mg/L α-NAA）培養(yǎng)基。而1 號培養(yǎng)基的出芽（成苗）率最低，沒有出芽；5 號、12 號、13 號、14 號和16 號培養(yǎng)基的出芽（成苗）率也均低于40%。

當(dāng)α-NAA 濃度為0.10 mg/L 時(shí)，隨著6-BA 濃度的升高，美國SL-9 甘薯莖尖組織的出芽（成苗）率也隨之增加；而當(dāng)α-NAA 的濃度在0.25～1.00 mg/L 時(shí)，美國SL-9 甘薯莖尖組織的出芽（成苗）率隨著6-BA 濃度的升高表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢。而且，當(dāng)6-BA 濃度為0.10 mg/L 時(shí)，其莖尖組織的出芽（成苗）率≤50%；當(dāng)6-BA 濃度為1.50 mg/L、α-NAA 濃度為0.25～1.00 mg/L時(shí)，其莖尖組織的出芽（成苗）率也≤50%。

2.3 不同激素濃度配比對平均苗高（或芽長）的影響

在16種培養(yǎng)基中，平均苗高（或芽長）排在前三位的分別是15 號、11 號和16 號（1.50 mg/L 6-BA＋1.00 mg/L α-NAA）培養(yǎng)基，其平均苗高（或芽長）在9.0 mm及以上。

表1 培養(yǎng)40 d 后各處理的甘薯莖尖組培效果

2.4 綜合評價(jià)不同激素濃度培養(yǎng)基的莖尖培養(yǎng)效果

從綜合評價(jià)值排序（表2）可以看出，11 號培養(yǎng)基（1.00 mg/L 6-BA＋0.50 mg/L α-NAA）的綜合評價(jià)值最大，y=1.805，L=83.3%，M=100.0%，N=11.4 mm，表明其綜合培養(yǎng)效果最好；其次為15 號培養(yǎng)基（1.00 mg/L 6-BA ＋1.00 mg/L α-NAA），其yi=1.738，L=75.0%，M=87.5%，N=11.8 mm；第三為4 號培養(yǎng)基（1.50 mg/L 6-BA＋0.10 mg/L α-NAA），y=1.474，L=75.0%，M=100.0%，N=7.7 mm；綜合評價(jià)值最小的是1 號培養(yǎng)基（0.10 mg/L 6-BA＋0.10 mg/L α-NAA），y=0.105，L=37.5%，而M 和N 值均為0。因此可知，試驗(yàn)篩選得到的美國SL-9甘薯莖尖組培的最適培養(yǎng)基激素濃度配比為1.00 mg/L 6-BA＋0.50 mg/L α-NAA。

表2 無量綱化處理后的數(shù)據(jù)及各處理的綜合評價(jià)值

從表2 中還可看出，在0.10、0.50 和1.00 mg/L 6-BA水平內(nèi)，α-NAA 的濃度為0.50 mg/L 時(shí)，甘薯莖尖培養(yǎng)效果的綜合評價(jià)值較高；當(dāng)6-BA 處在相對較高的濃度水平1.50 mg/L 時(shí)，α-NAA 的濃度只有在相對較低水平0.10 時(shí)，綜合評價(jià)效果才表現(xiàn)最佳。在0.25、0.50 和1.00 mg/Lα-NAA 水平內(nèi)，6-BA 的濃度水平均在1.00 mg/L時(shí)培養(yǎng)基培養(yǎng)效果的綜合評價(jià)值較高，綜合評價(jià)效果表現(xiàn)最佳。

3 小結(jié)

試驗(yàn)篩選出的11 號和15 號培養(yǎng)基，不僅愈傷組織誘導(dǎo)率L 和出芽（成苗）率M 高[L（11）=83.3%，M（11）=100.0%；L（15）=75.0%，M（15）=87.5%]，而且成苗速度較快，培養(yǎng)時(shí)間較短（二者接種培養(yǎng)40 d 后的苗高分別為：11.4 mm 和11.8 mm），均適用于高淀粉甘薯品種美國SL-9 的莖尖脫毒培養(yǎng)。其中，11 號培養(yǎng)基（1.00 mg/L 6-BA＋0.50 mg/L α-NAA）的綜合培養(yǎng)效果要稍好于15號（1.00 mg/L 6-BA＋1.00 mg/L α-NAA），主要表現(xiàn)為其愈傷組織誘導(dǎo)率和出芽（成苗）率相對要高，而幼苗生長速度卻相對稍慢，但兩者之間幾乎無差別。

4 討論

4.1 激素濃度及配比與組培培養(yǎng)效果的動態(tài)關(guān)系討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，莖尖組培的愈傷組織誘導(dǎo)率L 和出芽（成苗）率M 會隨著NAA 濃度的增大而減小；并且這一范圍的大小還可能與相配伍的6-BA 的濃度有關(guān)。如表1 所示，當(dāng)6-BA 的濃度為0.10 mg/L 時(shí)，α-NAA 濃度值在0.50～1.00 mg/L（或更大）的范圍內(nèi)與M 值呈負(fù)相關(guān)，而當(dāng)6-BA 的濃度增大為1.50 mg/L 時(shí)，這一范圍便增大到0.10～1.00 mg/L（或更大）。從而筆者認(rèn)為α-NAA 濃度對組培愈傷組織誘導(dǎo)率和出芽（成苗）率的影響可能呈拋物線狀的變化趨勢，并且這一拋物線的跨度可能與6-BA 的濃度成正比。即6-BA的濃度越大，α-NAA 濃度與L、M 呈負(fù)相關(guān)的范圍便越大。而α-NAA 濃度變化對平均苗高N 的影響卻很小。另外，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)α-NAA 濃度一定時(shí)，在一定范圍內(nèi)，平均苗高N 和成苗率M 可能隨6-BA 濃度增大而增大，不過當(dāng)兩種激素濃度均處于較高水平時(shí)，增大幅度會減小甚至反向變化。

綜上所述，可推測6-BA 對莖尖組培芽苗伸長生長的作用可能要比α-NAA 大，α-NAA 對愈傷組織誘導(dǎo)的作用可能比6-BA 大，而出芽（成苗）率可能受兩種激素的影響都比較大，這與曹秀敏等[4]的研究結(jié)果相似。

另外，初步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)6-BA 的濃度大于或等于α-NAA 的濃度時(shí)，培養(yǎng)基的綜合評價(jià)排序普遍靠前，而當(dāng)6-BA 的濃度小于α-NAA 的濃度時(shí)，排序普遍靠后。這表明，當(dāng)6-BA 的濃度大于或等于α-NAA 的濃度時(shí)，綜合培養(yǎng)效果相對較好，更有利于誘導(dǎo)成苗和幼苗生長。

對于甘薯莖尖組培中兩種激素的適宜濃度及配比，根據(jù)前人的研究可以總結(jié)出一個(gè)大概的濃度范圍：6-BA為0.5～1.0 mg/L，α-NAA 為0.01～1.0 mg/L，并且前者的濃度通常要大于后者的濃度。例如：阮龍等[5]對皖薯3 號等3個(gè)甘薯品種進(jìn)行莖尖組培時(shí)發(fā)現(xiàn)，MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L α-NAA 組成的培養(yǎng)基培養(yǎng)效果表現(xiàn)較好，培養(yǎng)40 d 后的出芽率均在85.0%以上；而尚佑芬[6]等篩選得到的培養(yǎng)基MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L α-NAA，其培養(yǎng)的莖尖組織平均發(fā)芽率達(dá)到97.3%，成苗率達(dá)76.5%，接種后43～60 d 的苗高即有5 cm 左右。陳玉霞等[7]用MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L α-NAA 培養(yǎng)鄂薯1 號和“51-93”等多個(gè)甘薯品種，40 d 后測得的成苗率為31.2%～100.0%；王芳等[8]用附加有1.0mg/L6-BA＋0.1 mg/Lα-NAA的MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)彩薯1 號，50 d 后的成苗率為40.0%。試驗(yàn)所得結(jié)果均符合前人的這一經(jīng)驗(yàn)范圍。

4.2 組培效果評價(jià)指標(biāo)及評價(jià)方法

在實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，愈傷組織誘導(dǎo)率和出芽（成苗）率的大小均在一定程度上受到外植體褐化死亡現(xiàn)象的影響。當(dāng)培養(yǎng)早期由于各種難以把握的非激素原因（如：外植體的取材時(shí)間和部位、植物的生理活動、培養(yǎng)基中無機(jī)鹽和肌醇濃度高低、消毒時(shí)間及消毒液的濃度等等）導(dǎo)致外植體褐死數(shù)目增加時(shí)，理論上能夠形成愈傷組織或幼苗的外植體數(shù)目就會減少，甚至在理論水平上愈傷組織誘導(dǎo)率或成苗率要高的激素水平可能受其影響而變得很低。總之，即其他非激素因素通過造成外植體的褐變死亡可能對不同激素水平處理的效果差異產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。而褐變死亡這一復(fù)雜的生理生化現(xiàn)象是很難消除的，只能從數(shù)據(jù)的處理方面盡量減少其對激素處理的差異顯現(xiàn)帶來的干擾。

因此，為了能夠更準(zhǔn)確地表現(xiàn)出激素處理與培養(yǎng)物生長的關(guān)系，筆者在原有通用的兩個(gè)評價(jià)指標(biāo)（愈傷組織誘導(dǎo)率和成苗率）的基礎(chǔ)上增加了另外一個(gè)指標(biāo)——平均芽長（苗高），即一定時(shí)間內(nèi)芽或苗生長的高度，該指標(biāo)可直接反映出組織在培養(yǎng)基中的生長速度，與激素濃度的關(guān)系更直接。

然而，在組織培養(yǎng)中利用線性綜合模型來評價(jià)不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)效果，篩選出最適培養(yǎng)基激素濃度配比的做法，在之前的報(bào)道中幾乎沒有，在該試驗(yàn)中屬于創(chuàng)新應(yīng)用，因此此評價(jià)方法的有效性、準(zhǔn)確性和可重復(fù)性還有待更多的試驗(yàn)驗(yàn)證。

另外，雖然組培成苗的快慢主要與芽分化和生長的快慢有關(guān)，但嚴(yán)格的成苗速度還應(yīng)該與叢芽根系誘導(dǎo)生長的快慢有關(guān)，因此針對高淀粉甘薯品種美國SL-9 的快速成苗還需要在篩選最適生根培養(yǎng)基方面作進(jìn)一步研究。同時(shí)，成苗快慢與幼苗的質(zhì)量之間是否存在一定的關(guān)系，還需深入研究。

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