葡萄胎病理相關新基因F10重組蛋白的表達及鑒定

龐戰(zhàn)軍，周君桂

0 引 言

在我們前期的研究中，為研究滋養(yǎng)層有節(jié)制侵入的分子機制，選擇滋養(yǎng)層侵襲性正常的早孕絨毛和滋養(yǎng)層發(fā)育異常的完全性葡萄胎組織標本，采用抑制性消減雜交的方法，建立了完全性葡萄胎與正常早孕絨毛間的差示cDNA文庫，以期篩選出在葡萄胎組織中異常表達的基因，從而進一步揭示滋養(yǎng)層侵襲性調(diào)節(jié)的分子機制。結(jié)果篩選到3條功能未知的基因片段，并獲得了其中一條新基因F10(Gen-Bank登錄號AB19629)的全長序列，經(jīng)原位雜交實驗證實其在葡萄胎組織中呈高表達［1］。熒光定量PCR實驗的結(jié)果顯示:F10在葡萄胎、侵蝕性葡萄胎、絨癌組織中全部呈陽性表達，且按上述順序F10陽性表達強度依次遞增，提示F10基因可能與滋養(yǎng)細胞侵襲性有關［2］。另外證實，F(xiàn)10在子宮頸、子宮內(nèi)膜等正常組織及癌旁組織不表達，在卵巢腺癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等腺癌中陽性表達，提示新基因F10不僅與滋養(yǎng)細胞腫瘤密切相關，還可能參與某些腺癌的發(fā)生［3－5］。為進一步研究F10基因的功能，我們擬構(gòu)建F10基因的表達載體，分離純化F10基因編碼蛋白，為F10單克隆抗體的制備及表達研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑 Es Taq DNA Polymerase，T4 DNA Ligase，快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，DH5α感受態(tài)細胞，BL21(DE3)感受態(tài)細胞，Rosseta(DE3)感受態(tài)細胞，質(zhì)粒小提試劑盒，Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒，SDS×PAGE凝膠制備試劑盒，Protein Show-G250蛋白快速染色液，中分子量蛋白Marker，RPMI 1640培養(yǎng)基，胎牛血清，DMSO，ProteinShow-G250蛋白快速染色試劑(CWbio.Co.Ltd)。表達載體pET28a，限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ(Fermentas)。酶標儀，BIO-RAD 680;HD-4層析工作站，上海滬西儀器廠;層析柱，Phamacia;蛋白電泳裝置，BioRadⅡ;蛋白定量檢測儀，Amersham Biosciences。

1.2 實驗方法與步驟

1.2.1 F10基因全長序列的克隆 根據(jù)F10基因全長序列設計并合成引物，上游引物F10-1添加BamHⅠ酶切位點，下游引物F10-2添加HindⅢ酶切位點(劃線處)，具體序列如下:F10-1:5'CGCGGATCCATGCCTGTGCACACGCTGAGC3';F10-2:5'CCCAAGCTTCTAGCCTTCAGCTGCTGGGCTCTC 3'。用Es Taq DNA Polymerase進行PCR反應，擴增目的片段F10。反應體系如下表所示:10×Es Taq buffer 5μL，dNTP(2.5 mmol/L each)4 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，cDNA 2 μL，F(xiàn)10-1(10 μmol/L)1 μL，F(xiàn)10-2(10 μmol/L)1 μL，Es Taq DNA Polymerase 0.5 μL，水33.5μL，共50μL。擴增條件:94℃ 10min預變性;94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 60 s共30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結(jié)果，紫外燈下切取目的DNA片段F10，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，步驟按凝膠回收試劑盒說明書進行。

1.2.2 F10基因原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建 參考文獻［6－7］的方法，將PCR擴增回收的F10目的片段用BamHⅠ/HindⅢ進行雙酶切，37℃酶切2 h，反應完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切結(jié)果，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。載體pET28a的線性化:pET28a用BamHⅠ/HindⅢ進行雙酶切，37℃酶切2h，反應完畢后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢查酶切結(jié)果，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段。

用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切回收的目的片段F10與線性化的pET28a進行連接，連接體系如下:pET28a 3.5 μL，F(xiàn)10 5.3 μL，10 × T4 DNA Ligase buffer，1 μL，T4 DNA Ligase，0.2 μL，共 10 μL。22 ℃連接4 h，將連接液10 μL轉(zhuǎn)化DH5α，步驟見康為世紀DH5α感受態(tài)細胞使用說明。次日，挑取白色單菌落，進行菌落PCR，菌落PCR體系如下:2×Taq MasterMix 7.5 μL，F(xiàn)10-1(10 μmol/L)0.4 μL，F(xiàn)10-2(10 μmol/L)0.4 μL，水 6.7 μL，共 15 μL。擴增條件:94℃ 10 min預變性;94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃60 s共30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。菌落PCR鑒定正確的菌株提取質(zhì)粒pET28a::F10，進行序列測定。

1.2.3 F10基因重組蛋白的誘導表達 測序正確的重組表達質(zhì)粒pET28a::F10轉(zhuǎn)化BL21(DE3)和Rosseta感受態(tài)細胞，構(gòu)建表達菌株 BL21(DE3)(pET28a::F10)和Rosseta(pET28a::F10)。構(gòu)建好的表達菌株BL21(DE3)(pET28a::F10)和Rosseta(pET28a::F10)分別接種于LB培養(yǎng)基(含有100 μg/mL Km)中，37℃振蕩培養(yǎng)、過夜活化。次日，按1%比例轉(zhuǎn)接于新鮮 LB培養(yǎng)基(含有100 μg/mL Km)中，37℃、離心半徑3 cm，250 r/min振蕩培養(yǎng)，至吸光度(A600)值約為0.6時，分別加入終濃度為0、0.1、1、2 mmol/L IPTG，37 ℃、250 r/min 誘導4 h。8000×g離心1mL菌液，棄上清，加入40μL 1×PBS懸浮菌體，加入10 μL的5×SDS上樣緩沖液，混勻后100℃ 煮沸10min，12000×g離心10min，取其上清液進行SDS-PAGE電泳檢測。同樣上述誘導的2 mL菌液離心收集，加400 μL 1×PBS懸浮菌體，用超聲破碎儀超聲破碎菌液，直至菌液清亮。4℃離心10 min，取40 μL 上清，沉淀用 40 μL PBS 重新懸浮，然后上清和沉淀中分別加入10 μL 5×SDS上樣緩沖液，沸水煮沸10min，離心后取上清液進行SDSPAGE電泳檢測。

1.2.4 F10基因重組蛋白的純化 將表達菌株BL21(DE3)(pET28a::F10)接種于2 L新鮮LB培養(yǎng)基(含有100 μg/mL Km)中，37℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)至 A600約為0.6時，加入1 mmol/L IPTG，37℃、250 r/min誘導4 h。離心收集誘導后菌液，用150 mL 1×PBS重懸，超聲破碎，分別收集上清與沉淀，用0.5%Triton 和1、2、4、8 mol/L 尿素洗滌包涵體沉淀，分別收集上清與沉淀進行SDS-PAGE電泳檢測。根據(jù)電泳檢測結(jié)果將目的蛋白濃度最高的尿素洗滌液，過 Ni柱進行蛋白純化，分別用 5、20、50、100、250、500 mmol/L咪唑進行洗脫，收集洗脫液，進行SDS-PAGE電泳檢測，詳細步驟見Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒使用說明(康為世紀)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增F10基因片段 以之前我們登錄GenBank的 F10基因全長 cDNA序列為模板，以F10-1/2為引物，PCR擴增目的片段F10(約900 bp)，瓊脂糖凝膠電泳驗證，與預期大小一致。見圖1。

圖1 片段F10的PCR電泳圖Figure 1 Electrophoresis of PCR-amplified F10 fragment

2.2 表達質(zhì)粒菌落的PCR鑒定 用制備的F10基因表達載體轉(zhuǎn)染DH5α菌株，制備感受態(tài)菌，篩選獲得的DH5α(pET28a::F10)菌落PCR擴增的條帶，約為900bp，與預期F10基因序列大小一致。見圖2。

2.3 F10表達質(zhì)粒序列測定 原核表達質(zhì)粒pET28a::F10進行序列測定，用NCBI-Blast將測序結(jié)果與GenBank中登錄的F10 cDNA序列進行序列比對，測序結(jié)果顯示序列完全一致，表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。pET28a::F10具體測序序列如下:TAGAAATA-

圖2 表達質(zhì)粒的菌落PCR電泳圖Figure 2 Electrophoresis of the plasmid expression by bacterial colony PCR

2.4 外源蛋白的誘導表達 37℃表達菌株BL21(DE3)(pET28a::F10)和 Rosseta(pET28a::F10)在不同濃度IPTG誘導后，表達的目的蛋白約35 000，與預期大小一致，見圖3。目的蛋白主要以包涵體表達，見圖4。

圖3 F10誘導小試電泳圖Figure 3 Small scale induced expression of F10

圖4 F10誘導形式電泳圖Figure 4 Electrophoresis of the induced expression of the F10 recombinant protein

2.5 F10基因重組蛋白的純化 包涵體沉淀用不同濃度尿素洗滌，電泳檢測結(jié)果顯示，8 mol/L的尿素洗滌液中溶出較多目的蛋白。將8 mol/L尿素洗滌液過Ni柱純化蛋白，收集咪唑洗脫液進行SDSPAGE電泳檢測，結(jié)果顯示50～500 mmol/L咪唑洗脫液中，目的蛋白純度較好，見圖5。

將目的蛋白濃度較高的樣品用超濾管濃縮，濃縮的蛋白濃度為1mg/mL，純度＞90%，見圖6。

圖5 蛋白F10純化電泳圖Figure 5 Electrophoresis of the purified F10 recombinant protein

圖6 蛋白濃縮后電泳圖Figure 6 Electrophoresis of the concentrated F10 recombinant protein

3 討 論

我們發(fā)現(xiàn)并克隆的F10基因，序列全長980 bp，ORF 885 bp，編碼蛋白由295個氨基酸組成。經(jīng)生物信息學分析，結(jié)果顯示:F10基因位于20號染色體，編碼蛋白分子式為C1355H2217N429O408S7，相對分子質(zhì)量 31 270.5，理論等電點為 10.46，脂肪簇指數(shù)72.85，總平均親水性(GRAVY):－ 0.502，估計半衰期在體外人網(wǎng)織紅細胞為30 h，屬不穩(wěn)定蛋白。Hum-mPLoc 2.0軟件分析結(jié)果顯示:F10編碼蛋白位于細胞質(zhì)或中心體。LOCtree分析提示F10編碼蛋白為DNA結(jié)合蛋白。

為初步了解F10與腫瘤細胞的關系，采用反義RNA轉(zhuǎn)染基因沉默技術，將人子宮內(nèi)膜癌KLE細胞系中的F10基因沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F10基因的沉默對KLE細胞的增殖有明顯的抑制作用，F(xiàn)10基因沉默的KLE細胞凋亡率分別較對照組增加2.4倍(24h)和3.6 倍(48 h)［8］。構(gòu)建 F10 基因的真核表達載體，轉(zhuǎn)染重組 pRc-CMV2-F10質(zhì)粒于肺癌細胞系A549，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F10有促進細胞增殖的作用，并提高A549細胞株中增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和cyclin D1的表達水平，說明F10基因可通過上調(diào)PCNA和cyclin D1的表達促進細胞的生長增殖［9］。另外證實annexin I(鈣依賴、磷脂結(jié)合蛋白)、STAT1(信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子)、腦富含膜附著信號蛋白1(brain acid soluble protein 1，BASP1)在正向F10基因轉(zhuǎn)染組高表達，鈣非依賴型磷脂酶A2、死亡相關轉(zhuǎn)錄因子1則表達降低［10］。此外，F(xiàn)10基因瞬間轉(zhuǎn)染 A549細胞48 h，可使核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1和核因子-κB與DNA的結(jié)合活性分別上升23%和下降49%［11］。另外還證實，F(xiàn)10基因可通過下調(diào)Caspase-3和Bax表達、上調(diào)Bcl-2表達而增強肺癌A549細胞株在裸鼠體內(nèi)的致瘤性［12］。以上我們的研究結(jié)果提示，F(xiàn)10極有可能與惡性腫瘤的細胞增殖及浸潤轉(zhuǎn)移密切相關，并有可能作為腫瘤基因治療的靶基因而受到更多的關注。

在我們之前的研究中，曾將F10基因融合連接入pET-GST原核表達載體，沒有移碼等讀碼框改變，表達和純化了Mr61000的F10/谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)融合蛋白。并利用純化的F10/GST融合蛋白免疫新西蘭白兔，獲得了F10基因產(chǎn)物的多克隆抗體，以此檢測了F10編碼蛋白在各種組織中的表達和分布［13］。但由于融合蛋白中的GST標簽未切除，由此制備的多克隆抗體不宜進行有關F10基因功能的精確研究。為此，本研究中選擇采用pET28a質(zhì)粒構(gòu)建表達載體，體外表達及純化，獲得高純度F10基因編碼蛋白，為下一步制備F10單克隆抗體及開展F10基因功能研究奠定基礎。

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