水楊酸鈉對急性百草枯中毒大鼠肺損傷的作用研究

錢 潔，陸曉曄，朱長清，呂利雄

0 引 言

百草枯中毒所致的肺損傷又稱為百草枯肺，早期以急性肺泡炎、急性呼吸窘迫綜合征為主要臨床表現(xiàn)，后期多出現(xiàn)廣泛肺間質(zhì)水腫及肺纖維化，是百草枯中毒的主要死因。由于缺乏特效解毒劑，百草枯中毒的病死率極高［1-3］。近期，Dinis-Oliveira等［4-6］采用水楊酸鈉治療百草枯中毒的研究為改善百草枯中毒預(yù)后帶來了新希望，其研究均提示水楊酸鈉及其衍生物有望成為能顯著改善百草枯中毒預(yù)后的藥物。本實驗旨在對此進行驗證，并進一步探討不同劑量水楊酸鈉對百草枯中毒大鼠肺的保護作用，觀察水楊酸鈉治療百草枯大鼠后的生存率及肺病理變化。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠59只，10～12周，體重200～300 g，購自中國科學(xué)院上海實驗動物中心斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物許可證號SCXK(滬)2007-0005，標準喂養(yǎng)(室溫20～25℃，相對濕度50%～70%，人工照明12 h日夜交替，自由飲水，標準飼料)。主要試劑為百草枯(1，1-二甲基-4，4-聯(lián)吡啶陽離子鹽，純度99%)、水楊酸鈉(2-羥基苯甲酸單鈉鹽)均購自Sigma公司，試劑以0.9%無菌等滲鹽水溶解稀釋后用于腹腔注射。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 動物以隨機數(shù)字法分為6組，正常對照組(給予等滲鹽水腹腔注射，6只);水楊酸鈉對照組(水楊酸鈉300 mg/kg腹腔注射，6只);百草枯A組(給予百草枯25 mg/kg染毒，11只);百草枯B組(給予百草枯35 mg/kg染毒，12只);水楊酸鈉A組［(百草枯25 mg/kg染毒，2 h后予水楊酸鈉(200 mg/kg)，12只)］;水楊酸鈉 B組［百草枯35 mg/kg染毒，2h后予水楊酸鈉(300mg/kg)，12只］。百草枯、水楊酸鈉均用等滲鹽水溶解后以1 mL體積腹腔注射［3-4］。

1.2.2 標本采集與制備 摘取急性期死亡大鼠的肺，并用無菌等滲鹽水溶液即時配制3%的戊巴比妥鈉，對28 d存活大鼠進行腹腔麻醉后摘取肺，置于中性甲醛溶液固定，制備石蠟切片，行常規(guī)HE染色、Masson染色，光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，各組的生存率采用Kaplan-Meier生存曲線進行描述，組間28 d生存率采用Fisher精確概率檢驗，Log-rank法比較各組間生存曲線差異。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生存率 實驗結(jié)果顯示:正常對照組和水楊酸鈉對照組全部存活，28 d生存率100%。百草枯A、B組和水楊酸鈉A、B組28 d生存率分別為36%、50%、42%、50%。百草枯A、B組28 d生存率較正常對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035，P=0.050)。與百草枯A組生存曲線比較，水楊酸鈉A組對百草枯鼠的生存期無明顯改善，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000)，水楊酸鈉B組與百草枯B組比較，生存期同樣無明顯改善，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000)。見圖 1。

圖1 百草枯組和水楊酸鈉治療組大鼠生存率曲線Figure 1 Survival curves of the paraquat-exposed and NaSAL-treated rats

2.2 一般狀況觀察 百草枯A、B組及水楊酸鈉A、B組大鼠給藥后1 d，即出現(xiàn)不同程度的毛發(fā)松散、瞇眼、口唇紫紺、步態(tài)蹣跚、易捕捉等現(xiàn)象，中毒后2～5 d癥狀最重，動物瀕死時出現(xiàn)深大呼吸、點頭樣呼吸或呼吸頻率加快，并出現(xiàn)明顯的全身紫紺;存活7 d以上的部分大鼠上述癥狀逐漸減輕。正常對照組和水楊酸鈉對照組未見明顯異常。

2.3 光鏡觀察 HE染色:正常對照組和水楊酸鈉對照組大鼠的肺結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁無塌陷，肺泡內(nèi)無滲出液、細胞浸潤，無毛細血管擴張、充血等表現(xiàn)。百草枯組急性期(第4天)病變主要為嚴重的肺泡炎性改變。同期水楊酸鈉A、B組的肺損傷病理學(xué)改變與百草枯A、B組相比無明顯改善。Masson染色:存活的百草枯A、B組的肺組織病理表現(xiàn)為肺泡間質(zhì)增寬，有大量染綠的膠原纖維增生沉積，部分肺泡腔萎縮消失。水楊酸鈉A、B組的肺病理切片表現(xiàn)類似，纖維化程度較百草枯組無明顯減輕。見圖2。

圖2 光鏡下正常對照大鼠及百草枯25 mg/kg染毒大鼠肺組織病理學(xué)改變Figure 2 Histopathological changes of the lungs in the normal control and paraquat-exposed rats

3 討 論

目前的研究表明，肺組織對百草枯的主動蓄積是導(dǎo)致肺損傷的首要因素。通過多胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，肺組織主動攝取并蓄積百草枯，導(dǎo)致百草枯在肺內(nèi)能維持一段時間的恒定水平，濃度甚至可達血清濃度的10～90倍，由此啟動了一系列相對不可逆的損傷反應(yīng)，最終導(dǎo)致肺纖維化。Rocco等［4］的研究顯示百草枯染毒大鼠肺內(nèi)膠原纖維含量從第1周開始即有所增加，持續(xù)到觀察終點第8周。Dinis-Oliveira等［5-7］指出，水楊酸鈉的治療作用主要是通過清除活性氧、抑制髓過氧化物酶、抑制前炎性因子、抑制血小板聚集等機制實現(xiàn)的。由此我們想到，水楊酸鈉是否能減少百草枯在肺內(nèi)的蓄積，通過遏制百草枯肺損傷的首要因素來發(fā)揮作用?答案是否定的。在Dinis-Oliveira等［3-5］的實驗中，水楊酸鈉治療組96 h后肺中仍可測得百草枯，百草枯含量與百草枯染毒組無顯著差異。由此可見，水楊酸鈉的作用機制可能并不在于直接減少或延緩百草枯的吸收，而在于抑制了百草枯啟動的損傷過程。

我們設(shè)想，通過增加水楊酸鈉用量的方式來提高肺內(nèi)藥物作用濃度及時間可能會獲得更好的療效。然而，本研究中水楊酸鈉A組并未獲得相對較高的生存率及病理改善。嘗試以更高劑量的百草枯(35 mg/kg)及水楊酸鈉(300 mg/kg)來分離水楊酸鈉的保護作用，同樣沒有取得預(yù)期的效果。我們的實驗并沒能重復(fù)獲得Dinis-Oliveira等［3-5］的實驗結(jié)果，水楊酸鈉治療后百草枯大鼠的生存率及病理結(jié)果無明顯改善。百草枯染毒大鼠的個體差異可能是導(dǎo)致這一結(jié)果的重要原因。我們的實驗觀察到，各組大鼠的中位生存期為3～5 d，以急性期1周內(nèi)死亡多見，而部分通過急性期的大鼠生存期均大于28d。組間存活大鼠的病理改變存在一定差異，個別百草枯大鼠肺損傷程度相對較輕，這種病理差異在既往的研究中也有多次報道。Ruiz等［8］的實驗中有20%的百草枯大鼠未出現(xiàn)肺纖維化，這些“耐受”大鼠與其余肺纖維化大鼠相比，膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶及其組織抑制物的表達有差異，這種差異可能與肺纖維化的產(chǎn)生相關(guān)。Satomi等［9］認為部分“耐受”大鼠未出現(xiàn)纖維化的原因可能與具有降解膠原蛋白的能力相關(guān)。

百草枯大鼠的預(yù)后存在個體差異，這種差異與百草枯中毒后引起不同個體的基因表達差異相關(guān)。Satomi等［10］運用基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)百草枯大鼠與正常對照大鼠之間存在108個基因的表達差異，同時觀察到部分百草枯大鼠中存在36種差異表達的基因，這導(dǎo)致了百草枯中毒大鼠預(yù)后的差異。

百草枯是人類致死率最高的農(nóng)藥之一，同時百草枯毒性存在種族間差異［11］，目前全球百草枯管理進入誤區(qū)，正是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)發(fā)展的源動力［12］。權(quán)威機構(gòu)所引用的百草枯半數(shù)致死量研究數(shù)據(jù)，本身存在兩大問題:觀察期太短和樣本量小。但基于動物福利和人道保護考慮，并遵循動物研究3R原則，歐洲經(jīng)濟合作組織推出的新急性毒性半數(shù)致死量測定方法，目前已經(jīng)得到美國、中國等管理機構(gòu)采納，這使得百草枯半數(shù)致死量研究限入困境，如固定劑量法每次只許用1只動物［13-15］。本研究動物數(shù)量雖然采用原研究方案，但百草枯生存率研究中樣本量問題沒有解決，俞愛青［16］和 Huang 等［17］的重復(fù)研究也未能得出原有結(jié)果。

我們將進一步探尋與百草枯中毒肺損傷相關(guān)的基因表達，明確影響基因表達的因素，并進一步從分子和基因水平為水楊酸鈉對百草枯中毒的作用尋找依據(jù)，可能是今后研究的方向。

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