重癥急性胰腺炎大鼠胃竇肌間血管活性腸肽神經(jīng)元的變化

張 誠，林 中，袁 園，段澤輝

0 引 言

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是臨床常見的急腹癥之一［1］，病死率高達15%～20%［2］。SAP時常見胃腸動力的下降，發(fā)生胃腸動力障礙，甚至出現(xiàn)胃腸功能衰竭。SAP伴胃腸動力障礙的發(fā)生機制十分復雜，仍未能闡明，有待研究及探討，目前認為可能與神經(jīng)因素、胃腸激素、腸道細菌、缺血再灌注損傷、炎癥介質(zhì)、Cajal間質(zhì)細胞等有關(guān)。神經(jīng)因素中腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system，ENS)起主要作用。ENS調(diào)控運動的神經(jīng)元包括興奮性神經(jīng)元和抑制性神經(jīng)元。血管活性腸肽(vasoactineintrestinalpeptide，VIP)為重要的 ENS抑制性神經(jīng)元。許多胃腸動力障礙疾病常伴隨著ENS的改變。本研究通過制造大鼠SAP模型，觀察胃竇肌間神經(jīng)叢的VIP陽性神經(jīng)元數(shù)目的變化，以探討其與SAP伴胃腸動力障礙的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性SD大鼠20只，體重200～220 g，由桂林醫(yī)學院動物實驗中心提供，實驗動物合格證號:SYXK桂2003-001。按隨機列表法分為假手術(shù)組和SAP模型組，每組10只。大鼠分籠飼養(yǎng)于20～22℃室溫下，相對濕度為45%～55%，自由飲食進水，每日光照明暗交替12 h。Anti Human Neuronal Protein HuC/HuD(anti-HuC/HuD，Molecular Probes公司);VIP(H-95)兔抗大鼠多克隆抗體(Santa Cruz公司);正常山羊封閉血清、FITC標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、TRITC標記山羊抗兔 IgG(H+L)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);?；悄懰徕c(Sigma公司);酚紅糊劑(4 g/L酚紅水溶液按15 mL/g面粉的比例加熱調(diào)成糊劑，天津科密歐化學試劑開發(fā)中心);氫氧化鈉、氫氧化鋇、硫酸鋅(廣東汕頭西隴化工有限公司);CRP ELISA檢測試劑盒(美國R＆D公司)。體視顯微鏡(日本奧林巴斯公司);倒置熒光相差顯微鏡(日本奧林巴斯公司);紫外分光光度計(日本島津公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立動物模型 大鼠術(shù)前24 h禁食，自由飲水，乙醚麻醉大鼠，假手術(shù)組開腹后，翻動十二指腸及胰腺3次，關(guān)腹。SAP模型組開腹后，辨認胰膽管走向及其在十二指腸的開口處，用針頭在胰膽管十二指腸開口處的對側(cè)腸壁一無血管區(qū)穿孔，用磨頓的頭皮針從腸壁穿孔處逆行滑行探入胰膽管，動脈夾夾閉胰膽管近腸壁端和近肝門端，頭皮針接微量泵泵入0.5 g/L牛黃膽酸鈉水溶液(1 mL/kg，0.1 mL/min)4～6 min，停止泵入后維持夾閉6～8 min，松開動脈夾、拔除針頭，回復腸段，關(guān)腹。假手術(shù)組和SAP模型組均皮下注射10 mL等滲鹽水。

1.2.2 檢測胃排空率、血清淀粉酶、C-反應蛋白(C-reactionprotein，CRP) 大鼠造模后禁食禁水24 h后，灌入酚紅糊劑(1 mL/100 g)，20 min后水合氯醛麻醉大鼠，下腔靜脈取血8 mL。以胃酚紅殘留率為指標評價胃排空率，人工碘比色法檢測血清淀粉酶，檢測CRP嚴格按照試劑盒操作。

1.2.3 胰腺HE染色 取胰頭部胰腺，置于體積分數(shù)為4%的甲醛中固定24 h后，制成HE標本。胰腺病理評分參照Schmidt法［1］，按組織水腫、炎性細胞浸潤、出血程度、胰腺壞死程度共4個參數(shù)評分，得分相加計算其總分值。

1.2.4 制作胃竇肌間神經(jīng)叢標本 用Kreb液將胃清洗干凈后，放于 Zamboni's固定液中伸展固定24 h;PBS磷酸鹽溶液清洗后，將胃竇部漿膜面朝上放于玻璃皿中，體視顯微鏡下用顯微鑷將漿膜層和肌層一同撕下，將漿膜面朝下，剝除其上附著的環(huán)形肌，剪成0.4cm×0.8cm大小，即制成胃竇肌間神經(jīng)叢標本。

1.2.5 雙重免疫熒光染色與結(jié)果判斷 ①染色方法:在室溫22℃下，將胃竇肌間神經(jīng)叢標本放入體積分數(shù)為10%的正常山羊封閉血清和體積分數(shù)為0.5%的TritonX-100的PBS中孵育45 min;4℃環(huán)境中，用小鼠來源的anti-HuC/HuD(10 μg/mL)和兔來源的VIP抗體(1∶100)分別孵育24 h;室溫22℃下，用 FITC標記的山羊抗小鼠IgG(1∶100)和TRITC標記的山羊抗兔IgG(1∶400)分別孵育45 min;甘油封片。孵育時，標本保持濕潤，以上每道程序后均用PBS漂洗3次，每次10 min。②結(jié)果判斷:用 anti-HuC/HuD作為一抗，F(xiàn)ITC標記的綠色熒光抗體作為二抗，顯示所有胃竇肌間神經(jīng)叢細胞;用VIP抗體作為一抗，TRITC標記的紅色熒光抗體作為二抗，顯示VIP陽性神經(jīng)元。用熒光顯微鏡觀察標本，計算胃竇肌間神經(jīng)叢細胞數(shù)和VIP陽性神經(jīng)元細胞數(shù)，每個樣本至少觀察200個胃竇肌間神經(jīng)叢細胞數(shù)。VIP陽性神經(jīng)元表達率計算公式:

神經(jīng)元表達率(%)=VIP陽性神經(jīng)元細胞數(shù)/胃竇肌間神經(jīng)叢細胞數(shù)×100%

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，胰腺病理評分、血清淀粉酶、CRP及胃排空率的比較用兩獨立樣本t檢驗，VIP陽性神經(jīng)元表達的比較用Mann-Whintney非參數(shù)檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 造模24h后，假手術(shù)組大鼠無死亡，一般情況良好，活動及反應正常，開腹后未見腹水、鈣化灶、胰腺病灶及胃潴留等胰腺炎相關(guān)表現(xiàn)。SAP模型組大鼠2只死亡，生存率為80%，存活大鼠精神萎靡，活動及反應遲緩，開腹后可見血性腹水、鈣化灶、胰腺出血壞死灶及胃腸道擴張等表現(xiàn)。

2.2 胰腺組織病理評分、血清淀粉酶、CRP及胃排空率的比較 光鏡下，假手術(shù)組胰腺組織僅見少量出血水腫，小葉結(jié)構(gòu)正常，無胰腺壞死灶區(qū)。SAP模型組小葉結(jié)構(gòu)紊亂，葉間隙增寬，可見大片狀壞死、大量出血和炎細胞浸潤。SAP模型組胰腺病理評分、血清淀粉酶、CRP高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而胃排空率低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。見圖1，表1。

2.3 VIP陽性神經(jīng)元表達的比較 胃竇肌間神經(jīng)叢細胞呈多態(tài)性，細胞核和細胞質(zhì)均染色，神經(jīng)纖維不著色。VIP陽性神經(jīng)元細胞質(zhì)染色，而細胞核不染色，神經(jīng)纖維著色呈串珠狀，連接于神經(jīng)節(jié)之間。見圖2。

圖1 大鼠胰腺病理改變(HE×200)Figure 1 The pathological lesion of the pancreas(HE×200)

表1 大鼠胰腺病理評分、血清淀粉酶、CRP、胃排空率及VIP陽性神經(jīng)元表達的比較()Table 1 The comparison of the score of pancreatic lesion，amylase，CRP，gastric emptying rate and the percentage of VIP neurons()

表1 大鼠胰腺病理評分、血清淀粉酶、CRP、胃排空率及VIP陽性神經(jīng)元表達的比較()Table 1 The comparison of the score of pancreatic lesion，amylase，CRP，gastric emptying rate and the percentage of VIP neurons()

與假手術(shù)組比較，*P ﹤0.05、＊＊P ﹤0.01

組別 n 胰腺病理評分(分) 血清淀粉酶(U/L) CRP(μg/mL) 胃排空率(%)VIP陽性神經(jīng)元的表達率(%)假手術(shù)組 10 1.60 ±0.52 360.20 ±30.29 35.71 ±6.43 70.99 ±1.82 10.72 ±1.92 SAP 模型組 8 14.63 ±1.06* 2061.25 ±434.86＊＊ 140.10 ±17.07* 31.49 ±3.96＊＊ 22.45 ±4.10＊＊

圖2 大鼠胃竇肌間VIP陽性神經(jīng)元的表達(雙重免疫熒光法 ×200)Figure 2 The immunofluorescence results of VIP positive neurons in gastric antrum myenteric ganglia(double-immunofluorescent staining×200)

3 討 論

VIP陽性神經(jīng)元是來自腸神經(jīng)系統(tǒng)的重要抑制性神經(jīng)元［4］，分泌 VIP 使胃腸道平滑肌舒張［5］。VIP是由28個氨基酸組成的一種直鏈結(jié)構(gòu)小分子神經(jīng)多肽［6］，主要有胃腸激素功能［7］、神經(jīng)肽功能［8］和免疫調(diào)節(jié)功能［9］。VIP廣泛分布于腸道和神經(jīng)系統(tǒng)，在結(jié)腸的含量最高，以神經(jīng)遞質(zhì)的方式發(fā)揮作用［10］。VIP通過 cAMP依賴的蛋白激酶途徑和NO相關(guān)性途徑來介導胃腸平滑肌的運動，引起胃排空減慢、參與結(jié)腸的節(jié)段非推進性運動和維持胃腸道規(guī)律的蠕動調(diào)節(jié)等作用［11－12］。研究表明SAP時VIP能通過影響胃腸道平滑肌電活動而導致胃腸動力障礙［13］。本研究組曾在大鼠小腸肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元和結(jié)腸平滑肌細胞體外共同培養(yǎng)實驗中發(fā)現(xiàn)VIP陽性神經(jīng)元在體外培養(yǎng)時發(fā)生了重塑［14］，亦發(fā)現(xiàn)SAP伴胃腸動力障礙時結(jié)腸黏膜下VIP陽性神經(jīng)元有變化［15］。胃為胃腸道的重要器官，是胃腸蠕動的重要部位。本研究以胃竇部為研究對象，旨在探討胃腸動力障礙時胃的變化;以血清淀粉酶、CRP、胰腺病理評分作為衡量造模成功與否和胰腺炎嚴重程度的標準;以胃排空率來判斷大鼠是否存在胃腸功能減弱;以雙重免疫熒光法測定VIP陽性神經(jīng)元的表達，實驗技術(shù)成熟，結(jié)果直觀可靠。SAP伴胃腸動力障礙大鼠ENS中胃竇肌間神經(jīng)節(jié)VIP陽性神經(jīng)元發(fā)生了重塑，VIP陽性神經(jīng)元的重塑與SAP伴胃腸動力障礙的神經(jīng)機制有關(guān)。

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