葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠急性結(jié)腸炎模型的建立與評價

徐麗紅，肖 芳，蘭小琴，何嘉怡，丁 強，田德安，鄭 勇

0 引 言

我國炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)已屬常見慢性腸道疾病，并以潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)多見。腹瀉是UC最常見的臨床癥狀，近年有學(xué)者提出腸道離子通道的功能受損所導(dǎo)致的水鹽吸收分泌失衡與UC相關(guān)性腹瀉關(guān)系密切，可能成為改善UC臨床癥狀的治療靶點［1］。葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate，DSS)誘導(dǎo)的急、慢性結(jié)腸炎模型被廣泛應(yīng)用于IBD的研究［2－5］，國內(nèi)在運用此模型進行研究時多選用BALB/c小鼠［5］，但其免疫學(xué)上表現(xiàn)為T細胞機能缺損，且免疫細胞活性隨月齡增加而逐漸下降［6］，在進行腸道免疫學(xué)研究時存在缺陷。C57BL/6J小鼠多數(shù)生物學(xué)特性與BALB/c小鼠相似，細胞免疫力隨月齡增加較少降低，故國外研究多選擇其進行腸道免疫學(xué)研究［2］，而國內(nèi)不多。本實驗選用 C57BL/6J小鼠構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎動物模型，旨在了解該模型中與腹瀉相關(guān)的疾病表現(xiàn)和組織病理學(xué)改變及離子通道 SLC26A3蛋白表達的改變，為利用C57BL/6J小鼠開展IBD中離子通道在腸黏膜免疫中作用機制的研究建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雌性健康 C57BL/6J小鼠，12只，6～8周齡，體重18～25 g，購自華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院實驗動物中心，實驗動物合格證號:SCXK(鄂)2010-0007。飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障系統(tǒng)［SYXK(鄂)2010-0057］，并使用華中科技大學(xué)實驗動物中心提供的全價營養(yǎng)顆粒飼料飼養(yǎng)(蛋白22.8%、脂肪4.91%、纖維4.24%)。

1.1.2 主要試劑 DSS(購自 Sigma公司)相對分子質(zhì)量35000～45000，硫磺含量為15.0%～20.0%;鄰甲苯胺-冰醋酸、多聚甲醛(購自武漢鼎國生物科技有限公司);乙醇和橄欖油(購自北京化學(xué)試劑公司);蘇木精、伊紅(上?；瘜W(xué)試劑廠產(chǎn)品)。蛋白提取試劑盒(Sigma公司產(chǎn)品)，Western blot制膠試劑盒、蛋白酶抑制劑PMSF及蛋白BCA濃度檢測試劑盒(購自武漢谷歌生物科技有限公司)，SLC26A3兔抗原一抗(購自百奇生物科技有限公司)，羊抗小鼠二抗(Santa Cruz公司產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 急性結(jié)腸炎模型的制備 C57BL/6J小鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組(n=6)和對照組(n=6)，模型組飲用濃度4%DSS(W/W，40 g/L)溶液7 d誘發(fā)急性潰瘍性結(jié)腸炎，然后改正常飲水。對照組大鼠正常飲水。

1.2.2 測量指標和方法 飲DSS溶液第1天起每天使用千分位電子天平稱量并記錄小鼠的體重、新鮮糞便的質(zhì)量和烘干后的質(zhì)量以計算糞便含水量。鄰甲苯胺-冰醋酸法行大便隱血試驗，并觀察記錄糞便性狀及肉眼血便情況。實驗第8天用濃度1%戊巴比妥50～60 mg/kg腹腔注射麻醉，剖腹觀察結(jié)腸外觀，沿系膜側(cè)剖開結(jié)腸，行組織學(xué)大體評分。取整段剪開結(jié)腸后沖洗干凈，固定于硬塑膠平板上，用4%甲醛溶液固定1 h，做瑞士卷，用4%甲醛溶液固定24 h，切片，HE染色，行組織病理學(xué)觀察。實驗結(jié)束后斷頸處死小鼠。

1.2.3 評分標準 結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)(disease activity index，DAI)評分參考文獻［7］。組織學(xué)大體評分參考文獻［8］。組織黏膜改變和周圍組織的黏連情況的評分總和為最后得分。組織病理學(xué)炎癥評分參考文獻［3］。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測結(jié)腸組織中SLC26A3的蛋白表達 2組各取3只小鼠結(jié)腸中遠段組織置于去蛋白酶處理的1.5 mL EP管中。每管加入組織裂解液RIPA buffer 500μL(含終濃度1mmol/L的蛋白酶抑制劑PMSF)，行組織研磨和超聲破碎，使組織細胞充分裂解，提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取80μg組織蛋白行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF轉(zhuǎn)印膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入SLC26A3抗體(1∶200)和GAPDH 抗體(1∶5000)，4℃孵育過夜，洗膜3次共25min，羊抗小鼠二抗(1∶3000)，常溫孵育1h，洗膜3次后增強化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 使用 SPSS 10.0軟件行統(tǒng)計分析，定量資料采用均數(shù)±標準差()表示，兩獨立樣本比較采用t檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠糞便含水量、體重和DAI變化趨勢 實驗中，2組小鼠均無死亡。模型組飲用4%DSS，第3～4天開始出現(xiàn)急性結(jié)腸炎癥狀，糞便松散、隱血試驗陽性最早于第3天出現(xiàn)，稀便和肉眼血便最早于第4天出現(xiàn)，糞便含水量在第3～4天開始明顯增加，實驗結(jié)束時模型組糞便含水量［(73.30±8.31)%］較實驗開始時［(44.32±6.42)%］升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004);實驗結(jié)束時對照組糞便含水量［(54.73± 3.69)%］較 實 驗 開 始 時 ［(48.42 ±9.69)%］差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.4);模型組DAI評分從第3天開始迅速上升，實驗結(jié)束時DAI評分(3.50 ±0.87)較實驗開始時(1.00 ±0.00)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000);實驗結(jié)束時對照組DAI值(1.0 ±0.00)較實驗開始時(1.33 ±0.57)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.06);模型組體重第5天開始明顯下降，實驗結(jié)束時小鼠體重［(13.5±0.90)g］較實驗開始時［(16.90±0.49)g］明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001)，對照組體重［(19.18 ±1.33)g］較實驗開始時［(17.72 ±1.18)g］有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.02)。見圖1。飲用DSS過程中，模型組出現(xiàn)毛發(fā)色澤變暗、精神萎靡、活動減少、反應(yīng)能力下降等表現(xiàn)。

2.2 組織學(xué)大體改變 實驗第8天，剖腹見模型組結(jié)腸腸壁充血水腫，部分腸道組織與周圍器官黏連，對照組小鼠的結(jié)腸腸壁光滑，排列整齊。取全段結(jié)腸，模型組小鼠的結(jié)腸長度［(4.8±0.8)cm］較對照組［(7.53±0.3)cm］短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，且模型組小鼠腸壁明顯增厚，管壁僵硬，腸黏膜廣泛充血、水腫，局部有糜爛、出血，可見淺潰瘍，病變累及整段結(jié)腸，以中段和遠段結(jié)腸為重。模型組組織學(xué)大體評分(4.50 ±0.84)較對照組(0.16 ±0.41)高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。

2.3 組織病理學(xué)改變 模型組結(jié)腸黏膜呈明顯的急性炎癥反應(yīng)，光鏡下表現(xiàn)為部分表面上皮脫落，炎癥主要累及黏膜、黏膜下層，炎性細胞以中性粒細胞和淋巴細胞為主，漿細胞少見，上皮內(nèi)杯狀細胞減少，隱窩破壞，見圖2。模型組結(jié)腸組織病理學(xué)炎癥評分(3.6 ±0.5)較對照組(0.33 ±0.5)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。

圖1 模型組和對照組小鼠糞便含水量、體重和DAI變化趨勢Figure 1 The water content in fecal，weight and DAI trends of two groups

圖2 模型組與對照組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)表現(xiàn)Figure 2 Histological results of two groups in mice of model group and control group

2.4 結(jié)腸組織SLC26A3的蛋白表達 蛋白免疫印跡實驗檢測結(jié)腸SLC26A3的蛋白表達，提示模型組較對照組結(jié)腸黏膜SLC26A3的蛋白表達量明顯降低。見圖3。

圖3 模型組與對照組小鼠結(jié)腸組織中SLC26A3的蛋白表達Figure 3 Protein expression of SLC26A3 of colon in mice of model group and control group

3 討 論

目前IBD的動物模型主要包括自發(fā)性模型、化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型、細胞移植模型、基因模型，這些模型各有其特征和獨特作用，其中以化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型操作簡單、時間短、重復(fù)性好、經(jīng)濟實用，應(yīng)用最為廣泛［3］。化學(xué)藥物誘導(dǎo)模型中常用的藥物包括乙酸、三硝基苯磺酸、噁唑酮、DSS、角叉菜膠、碘乙酰胺等。其中口服給藥DSS模型，由于其造模炎癥的輕重主要與DSS濃度有關(guān)而與小鼠攝入量關(guān)系不大［9］使造模過程相對容易控制，可行性較強。DSS結(jié)腸炎模型可用于各種大鼠、小鼠、倉鼠和豚鼠等，但動物種屬之間對DSS的易感性和病變部位存在差異［4］。C57BL/6J小鼠對DSS中度敏感，病變以直腸和左半結(jié)腸為主，與人類UC的好發(fā)病變部位相似，其免疫系統(tǒng)相對穩(wěn)定適宜用于涉及腸道免疫學(xué)研究的實驗。此外，DSS急性結(jié)腸炎模型的炎癥病變部位、病變進展過程和程度不僅與鼠的種屬、DSS的濃度有關(guān)，還與鼠生存環(huán)境有關(guān)［4］。為建立適合本實驗室的穩(wěn)定的實驗?zāi)Ｐ?，本實驗組曾參考文獻［3－4，9］，構(gòu)建不同濃度的DSS誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠模型，結(jié)果提示:6%濃度的DSS模型小鼠死亡率高，在實驗第6天所有小鼠死亡。3%和4%濃度的DSS模型小鼠在實驗結(jié)束時均存活，但前者腸道炎癥表現(xiàn)不明顯，部分小鼠至實驗結(jié)束時才出現(xiàn)稀便和糞便隱血實驗陽性，疾病進展過程不穩(wěn)定，不利于后期的實驗評估。4%濃度的DSS模型的小鼠不僅成模率高，存活率高，且小鼠個體之間差異較小，穩(wěn)定性較好。故本研究選擇以4%濃度DSS誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠急性結(jié)腸炎模型為觀察對象。

人類UC的炎癥病變局限于結(jié)腸黏膜及黏膜下層，多位于乙狀結(jié)腸和直腸，臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便。本組選擇的4%DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型的腹瀉癥狀主要為糞便不成形及稀水樣、血便，糞便含水量增加，在造模的第3～4天就達到高峰，并同時伴小鼠體重的迅速下降，DAI指數(shù)在造模的第6～7天達到高峰并伴小鼠出現(xiàn)明顯的皮膚松弛，眼窩凹陷等脫水現(xiàn)象，與人類中-重度UC的臨床表現(xiàn)極為相似。肉眼大體組織學(xué)觀察顯示，結(jié)腸炎癥改變從肛門側(cè)自下而上連續(xù)性發(fā)展，黏膜充血水腫，散在淺潰瘍，多位于右半結(jié)腸和直腸，并伴結(jié)腸縮短;顯微鏡下病理組織學(xué)觀察顯示，炎癥改變主要累及黏膜、黏膜下層，以中性粒細胞和淋巴細胞為主，隱窩破壞。上述特點與人類潰瘍性結(jié)腸炎組織學(xué)改變的特點也極為相似。因此可以認為所選模型適用于關(guān)于UC黏膜炎癥和腹瀉的相關(guān)研究。

腹瀉是IBD尤其是UC患者最常見的臨床表現(xiàn)之一，其間涉及多種病理機制，多數(shù)研究者認為水電解質(zhì)尤其是Na+和Cl－的腸道分泌吸收失衡是腹瀉發(fā)生的最主要的病理過程［10］。SLC26A3是一種腸道Cl－/HCO3－離子轉(zhuǎn)運體，在下消化道和Na+/H+轉(zhuǎn)運體3協(xié)同調(diào)節(jié)NaCl的吸收，其基因缺陷可導(dǎo)致先天性失氯性腹瀉［11］。關(guān)于IBD患者的人群研究證實SLC26A3主要在遠端結(jié)腸表達并發(fā)揮離子調(diào)控功能，UC患者的腸道SLC26A3 mRNA表達下降并伴有結(jié)腸隱窩Cl－/HCO3－交換能力的下降［1］。關(guān)于致病性大腸埃希菌腸炎［12］和檸檬酸桿菌腸炎［13］的研究發(fā)現(xiàn)細胞病變性腹瀉的發(fā)生亦與SLC26A3的黏膜表達下降有關(guān)。這些研究均提示SLC26A3的功能缺陷或表達受損是腸道炎癥性腹瀉的原因之一。本次試驗結(jié)果證實，在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中，伴隨腹瀉的發(fā)生，中遠段結(jié)腸組織SLC26A3的蛋白表達明顯減少，提示DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎性腹瀉亦和離子通道蛋白的表達受損具有相關(guān)性。

詳細了解離子通道SLC26A3在炎癥性腹瀉進展中的病理生理過程可使改善SLC26A3功能和平衡SLC26A3的表達成為治療腸道炎癥性腹瀉的新策略。近年有研究者提出在UC的發(fā)展過程中，SLC26A3、炎癥因子和腸黏膜免疫系統(tǒng)之間存在相互作用［14－15］，且腸道離子轉(zhuǎn)運功能受損和腸道黏膜屏障受損往往平行存在［16］，推測恢復(fù)受損SLC26A3的功能可能不僅有益于緩解UC患者的腹瀉而且有利于緩解UC的進展。本組實驗結(jié)果證實4%DSS誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠結(jié)腸炎模型與人類UC相比，不僅腹瀉特征相似，而且SLC26A3蛋白表達改變也相似，結(jié)合既往分析該模型中炎癥分子與免疫因子表達改變的文獻［2，5］，有理由相信該模型可用于離子通道、腸道炎癥和腸黏膜免疫在腸道炎癥性腹瀉中相互作用機制的研究，既可為尋找緩解炎癥性腹瀉的新方法提供幫助，也有助于探索治療UC的新策略。

［1］Farkas K，Yeruva S，Rakonczay Z Jr，et al.New therapeutic targets in ulcerative colitis:the importance of ion transporters in the human colon［J］.Inflamm Bowel Dis，2011，17(4):884-898.

［2］Bento AF，Leite DF，Marcon R，et al.Evaluation of chemical mediators and cellular response during acute and chronic gut inflammatory response induced by dextran sodium sulfate in mice［J］.Biochem Pharmacol，2012，84(11):1459-1469.

［3］Wirtz S，Neufert C，Weigmann B，et al.Chemically induced mouse models of intestinal inflammation［J］.Nat Protoc，2007，2(3):541-546.

［4］Perse M，Cerar A.Dextran sodium sulphate colitis mouse model:traps and tricks［J］. J Biomed Biotechnol，2012，2012:718617.

［5］吳 瑛，汪芳裕，魏 娟，等.甘露糖結(jié)合凝集素在小鼠葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎發(fā)病中的機制研究［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2010，23(2):141-144.

［6］馮仁田，潘宏志，何 維，等.Balb/C小鼠免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的增齡性變化［J］.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2000，19(3):174-177.

［7］Sutherland LR，Martin F，Greer S，et al.5-Aminosalicylic acid enema in the treatment of distal ulcerative colitis，proctosigmoiditis，and proctitis［J］.Gastroenterology，1987，92(6):1894-1898.

［8］Butzner JD，Parmar R，Bell CJ，et al.Butyrate enema therapystimulates mucosal repair in experimental colitis in the rat［J］.Gut，1996，38(4):568-573.

［9］Egger B，Bajaj-Elliott M，MacDonald TT，et al.Characterisation of acute murine dextran sodium sulphate colitis:cytokine profile and dose dependency［J］.Digestion，2000，62(4):240-248.

［10］Wenzl HH.Diarrhea in chronic inflammatory bowel diseases［J］.Gastroenterol Clin North Am，2012，41(3):651-675.

［11］Alper SL，Sharma AK.The SLC26 gene family of anion transporters and channels［J］.Mol Aspects Med，2013，34(2-3):494-515.

［12］Gill RK，Borthakur A，Hodges K，et al.Mechanism underlying inhibition of intestinal apical Cl/OH exchange following infection with enteropathogenic E.coli［J］.J Clin Invest，2007，117(2):428-437.

［13］Borenshtein D，Schlieper KA，Rickman BH，et al.Decreased expression of colonic Slc26a3 and carbonic anhydrase iv as a cause of fatal infectious diarrhea in mice［J］.Infect Immun，2009，77(9):3639-3650.

［14］Manoharan P，Coon S，Baseler W，et al.Prostaglandins，not the leukotrienes， regulate Cl－/HCO3－exchange (DRA，SLC26A3)in villus cells in the chronically inflamed rabbit ileum［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1828(2):179-186.

［15］Lee JH，Nam JH，Park J，et al.Regulation of SLC26A3 activity by NHERF4 PDZ-mediated interaction［J］.Cell Signal，2012，24(9):1821-1830.

［16］Lamprecht G，Gaco V，Turner JR，et al.Regulation of the intestinal anion exchanger DRA(downregulated in adenoma)［J］.Ann N Y Acad Sci，2009，1165:261-266.