實驗性肺纖維化小鼠循環(huán)單核細胞亞群的動態(tài)變化及意義

馬永強，姬文婕，鄭春秀，張譯丹，彭守春，胡道川，陳雪芬，周 欣，魏路清

0 引 言

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是慢性進行性纖維化型間質(zhì)性肺炎，病程不可逆且預后極差，近年來IPF的發(fā)病率呈上升趨勢［1－2］。目前其具體發(fā)病機制尚不清楚，但炎癥和免疫機制的觀點仍發(fā)揮重要作用［3］。單核細胞作為機體固有免疫細胞，在炎癥及免疫反應中扮演重要角色。小鼠主要存在2種循環(huán)單核細胞亞群，分別為Ly6ChiCCR2+CX3CR1－和 Ly6CloCCR2－CX3CR1+亞群，Ly6Chi單核細胞為炎癥性亞群［4］。單核細胞亞群的變化與疾病發(fā)展階段有密切關(guān)系［5］，本研究以博萊霉素誘導小鼠肺纖維化為模型，闡述在早期炎癥和后期纖維化病理進程中，不同單核細胞亞群比例的變化特點，分析Ly6Chi單核細胞比例變化與早期炎癥反應程度和后期纖維化指標的相關(guān)性，從而探討單核細胞表型偏移在肺纖維化發(fā)病過程中的作用及意義，為肺纖維化的基礎(chǔ)和臨床研究提供初步的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康SPF級C57BL/6J小鼠，雄性，6～8周齡(16～18g)，購自解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，許可證號:SCXK-(軍)2012-0004。小鼠在光照良好、通風、溫度和濕度適宜的清潔級動物室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)。注射用鹽酸平陽霉素(天津太河制藥有限公司)，F(xiàn)luorescein isothiocyanate(FITC)anti-mouse Ly6C抗體、Phycoerythrin(PE)anti-mouse CD11b抗體(Biolegend公司)，F(xiàn)ITC anti-Rat IgG2c抗體，PE anti-Rat IgG2b抗體，RNAiso Plus(TaKaRa)，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、Rnasin Inhibitor(Promega 公 司)，SYBR Green Master(Roche公司)，羥脯氨酸試劑盒(南京建成)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的制備和標本的采集 100只雄性C57BL/6J小鼠按隨機數(shù)字列表法分為博萊霉素組和等滲鹽水組，每組50只。參照Lakatos等［6］經(jīng)口咽吸入法制備肺纖維化模型，博萊霉素組小鼠緩慢注入40 μL博萊霉素A5(2 mg/kg)，等滲鹽水組小鼠注入相同體積無菌等滲鹽水。分別于術(shù)后第1、3、7、14和21天，輕度麻醉后，放血處死，EDTA 抗凝血并進行流式細胞術(shù)檢測;采集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)并進行細胞計數(shù)和分類;未灌洗小鼠右肺用于檢測膠原Ⅰ、Ⅲ的mRNA表達水平，左肺行病理學檢測;灌洗小鼠肺組織用于羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量的測定。

1.2.2 小鼠肺組織病理學檢測 肺組織在真空負壓條件下(15～20英寸汞柱，1英寸汞柱=3.386kPa)經(jīng)4%多聚甲醛(pH 7.2 ～7.4)固定 24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟及包埋，切片厚度為5 μm。按常規(guī)方法進行HE染色和Masson染色。參照Szapiel等［7］方法進行炎癥評分，每只小鼠選取3張連續(xù)切片，10×10倍觀察5個視野，避開大的支氣管和血管進行評分，0分:正常組織，1分:炎性細胞浸潤面積占肺組織面積比例＜20%，2分:比例為20% ～50%，3分:比例 ＞50%。取其平均值作為炎癥評分，代表肺組織的炎癥程度。采用Image-Pro Plus 6.0軟件對肺間質(zhì)纖維化程度進行分析，膠原容積分數(shù)(collagen volume fraction，CVF)代表肺纖維化程度，計算公式如下:

CVF=膠原面積/(圖像總面積－空白區(qū)域面積)

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液細胞計數(shù)和分類 BALF常規(guī)離心、重懸細胞，通過Count Star自動細胞計數(shù)儀計算細胞總數(shù);常規(guī)甩片、固定及HE染色，光學顯微鏡(Nikon E600POL)下觀察，計數(shù)200個細胞，計算巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞及嗜酸性粒細胞比例。

1.2.4 小鼠肺組織膠原Ⅰ、ⅢmRNA水平檢測 液氮研磨肺組織，Trizol法提取肺組織總RNA，甲醛變性電泳法檢測RNA完整性，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBR Green法進行實時定量PCR反應，引物如下:膠原I(正義鏈:5'-CATGTTCAGCTTTGTGGACCT-3'，反義鏈:5'-GCAGCTGACTTCAGGGATGT-3')，擴增產(chǎn)物長度為 94 bp。膠原Ⅲ(正義鏈:5'-TCCCCTGGAATCTGTGAATC-3'，反義鏈:5'-TGAGTCGAATTGGGGAGAAT-3')，擴增產(chǎn)物長度為63 bp。β-actin(正義鏈:5'-CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'，反義鏈:5'-ACCAGAGGCATACAGGGACA-3')，擴增產(chǎn)物長度為104 bp。以上引物均由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成。用2－ΔΔCt法對結(jié)果進行分析。

1.2.5 小鼠肺組織HYP含量測定 小鼠肺組織稱重，制備成組織勻漿，按照試劑盒說明書酸水解法水解肺組織，氯胺T法測定肺組織HYP含量。

1.2.6 流式細胞術(shù)檢測小鼠循環(huán)單核細胞亞群比例新鮮 EDTA 抗凝血 100 μL 加入 0.25 μg FITC antimouse Ly6C和0.25μg PE anti-mouse CD11b抗體混勻，用相同體積的FITC anti-Rat IgG2c抗體及PE anti-Rat IgG2b抗體設(shè)置同型對照;室溫避光孵育15 min;加入紅細胞裂解液，混勻后避光靜置10 min，流式細胞儀檢測。流式細胞儀分析時的設(shè)門策略:首先在FSC-SSC散點圖中，選定SSClo群，然后識別FSC/CD11b+細胞，最后根據(jù)該群Ly6C熒光強度劃分為Ly6Chi和Ly6Clo。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有定量資料采用均數(shù)±標準差()表示，計量資料滿足正態(tài)性及方差齊性，組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析及SNK法兩兩比較。不滿足正態(tài)性或方差齊性，以中位數(shù)、四分位間距描述原始數(shù)據(jù)，并采用非參數(shù)秩和Mann-Whitney檢驗。相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肺組織病理學變化 等滲鹽水組小鼠肺組織HE染色均未見明顯炎性細胞浸潤，肺泡間隔基本正常，肺泡結(jié)構(gòu)無破壞。而博萊霉素組第3天開始出現(xiàn)明顯炎癥反應，肺泡間隔增厚，第7天炎癥反應加重，可見大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚，炎癥評分為(2.53±0.08)分，而后炎性細胞浸潤減少，出現(xiàn)成纖維細胞增生和膠原沉積。Masson染色結(jié)果顯示，等滲鹽水組各時間點均未見明顯膠原沉積。而博萊霉素組第7天出現(xiàn)少量藍染的膠原纖維，第14天膠原纖維含量明顯增多，后膠原沉積持續(xù)加重，直至第21天，可見大量致密的藍色膠原纖維。見圖1。

圖1 各組小鼠不同時間點肺組織病理染色結(jié)果Figure 1 Results of pathological staining of the mouse lung tissue at different times

2.2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液細胞總數(shù)和分類計數(shù)結(jié)果 等滲鹽水組不同時間點BALF細胞總數(shù)和分類計數(shù)相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與等滲鹽水組相應時間點比較，博萊霉素組BALF細胞總數(shù)第3 天明顯增多(25.18 ±2.06 vs 8.82 ±1.59，P ＜0.01)，第7 天升至高峰(56.56 ±5.03 vs 3.68 ±0.79，P＜0.01)，后呈下降趨勢，第14、21天細胞總數(shù)仍高于等滲鹽水組(P＜0.01);肺泡巨噬細胞比例的變化趨勢與細胞總數(shù)相一致;與等滲鹽水組相比，博萊霉素組中性粒細胞總數(shù)第1、3、7天顯著高于等滲鹽水組(9.086 ±1.268 vs 1.108 ±0.229、5.551 ±0.511 vs 0.315 ±0.100、8.093 ±0.922 vs 0.249 ±0.074)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而后呈下降趨勢，第14、21天中性粒細胞數(shù)與等滲鹽水組相比，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見圖2。

2.3 各組小鼠肺組織膠原Ⅰ、Ⅲ mRNA表達水平的變化 與等滲鹽水組相比，博萊霉素組第14天和第21天膠原Ⅰ、ⅢmRNA相對表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖2。

2.4 各組小鼠肺組織HYP含量的變化 等滲鹽水組不同時間點HYP含量相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與各組小鼠肺組織Masson染色膠原容積分數(shù)計算結(jié)果相一致，與等滲鹽水組相比，博萊霉素組第7、14、21天HYP含量均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。博萊霉素組內(nèi)兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。

2.5 各組小鼠不同單核細胞亞群比例的變化 循環(huán)Ly6Chi單核細胞比例在博萊霉素致肺損傷后迅速升高，出現(xiàn)高峰時間(第3天)早于肺間質(zhì)炎性細胞浸潤及BALF細胞總數(shù)達到峰值的時間(第7天)，在纖維化進展期Ly6Chi單核細胞比例較早期明顯降低。與等滲鹽水組比較，給予C57BL/6J小鼠博萊霉素干預后第1天Ly6Chi單核細胞比例明顯升高(P＜0.01)，第3天達到高峰(P＜0.01)，而后逐漸下降，但第7、21天仍高于等滲鹽水組(P＜0.05)。博萊霉素組Ly6Clo單核細胞亞群比例變化與Ly6Chi變化趨勢相反。等滲鹽水組小鼠循環(huán)單核細胞Ly6Chi亞群比例占優(yōu)勢，不同時間點等滲鹽水組小鼠循環(huán)單核細胞亞群比例變化幅度小，差異無統(tǒng)計學意義。見圖3。

2.6 Ly6Chi單核細胞亞群與炎癥和纖維化指標的相關(guān)關(guān)系 博萊霉素干預后，循環(huán)Ly6Chi單核細胞表現(xiàn)為快反應細胞群，第1天迅速升高，在炎癥反應期維持較高水平。我們將各組小鼠Ly6Chi單核細胞比例分別與肺組織IS和CVF進行相關(guān)性分析，Ly6Chi亞群細胞比例變化與IS及CVF值均呈明顯正相關(guān)(分別為 r=0.636，P ＜0.01;r=0.443，P=0.0013)。根據(jù)以上結(jié)果得知，博萊霉素組Ly6Chi的比例在第3 d達到峰值，而肺組織IS和CVF值分別于第7、21天最高，因此，將前者與后兩者分別進行相關(guān)分析顯示，Ly6Chi(3天)比例與IS(7天)呈明顯正相關(guān)(r=0.934，P ＜0.01)，Ly6Chi(3 天)比例與 CVF(21 天)呈明顯正相關(guān)(r=0.983，P ＜0.01)。見圖3。

圖2 各組小鼠不同時間點肺組織炎癥評分、BALF細胞計數(shù)及肺纖維化不同指標變化結(jié)果Figure 2 Inflammation score，cell count in the BALF and changes of pulmonary fibrosis markers in the normal saline(NS)and bleomycin(BLM)groups at different times

圖3 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠不同時間點單核細胞亞群比例的變化及Ly6Chi亞群比例與炎癥評分、膠原容積分數(shù)的相關(guān)性分析Figure 3 Monocyte subsets detected by flow cytometry and correlation of the percentage of Ly6Chimonocytes，with inflammation score and collage volume fraction in the normal saline(NS)and bleomycin(BLM)groups

3 討 論

IPF是彌漫性肺間質(zhì)纖維化中最常見的、致死性最高的一種。由于其發(fā)病過程的自身特點，很難找到有效的預防和治療方法［8］。近年來，國內(nèi)外學者從細胞因子水平干預及免疫調(diào)節(jié)等方面對博萊霉素致纖維化的發(fā)病機制進行了廣泛探索，然而肺纖維化的確切發(fā)病機制尚未完全闡明［3，9］。大量研究表明炎癥反應的異常調(diào)節(jié)在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，目前IPF仍被認為是一種肺實質(zhì)慢性炎癥性疾?。?，10］。

循環(huán)單核細胞廣泛參與了機體炎癥反應、防御和組織重塑等過程。外周血中成熟單核細胞形態(tài)存在異質(zhì)性，不同單核細胞亞群反映了具有不同生理功能的發(fā)展階段［5］。人和小鼠血中存在2種主要的單核細胞亞群，并且有一定的相似性［11］，在小鼠中一種為Ly6ChiCCR2+CD62L+CX3CR1low，因早期招募至炎癥區(qū)域而被認為是促炎癥表型，另一種Ly6CloCCR2－CD62L－CX3CR1hi亞群發(fā)揮巡察功能，并且可以補充組織固有巨噬細胞［12］。Ly6Chi單核細胞亞群的動態(tài)變化與炎癥反應的不同階段關(guān)系密切，有研究報道，小鼠體內(nèi)C-C趨化因子水平的升高，促進了循環(huán)及二級淋巴組織中Ly6Chi單核細胞亞群比例選擇性增高，在小鼠實驗性肺纖維化模型中，纖維化進展期消除以Ly6Chi為主的循環(huán)單核細胞能夠減輕纖維化程度［4，13］。

博萊霉素經(jīng)口咽吸入途徑作用于肺，循環(huán)中Ly6Chi單核細胞比例第1天明顯升高，第3天達到最高點隨后呈現(xiàn)下降趨勢。與此相伴行，博萊霉素干預第3天，病理學結(jié)果證實肺間質(zhì)炎性細胞的浸潤、肺泡壁水腫等炎癥表現(xiàn)，在第7天時最為顯著，肺泡灌洗液的分類計數(shù)結(jié)果與肺組織病理檢測相一致。Ly6Chi單核細胞比例的變化與炎癥反應(以IS半定量法評價)呈明顯正相關(guān)。而病理學方法、蛋白及核酸水平的檢測表明，在博萊霉素干預后的不同時間點細胞外基質(zhì)沉積程度在第21天達到最高。Ly6Chi單核細胞與后期纖維化指標存在明顯的相關(guān)關(guān)系。炎癥過程中，單核細胞在組織局部浸潤并分化的巨噬細胞至少存在2種功能互補的亞群［14］。第1種由典型單核細胞(Ly6Chi亞群)分化產(chǎn)生，表現(xiàn)為典型活化狀態(tài)(M1表型)，第2種由非典型單核細胞(Ly6Clo亞群)分化而來，表現(xiàn)為替代活化狀態(tài)(M2表型)。目前認為M1型巨噬細胞介導過度炎癥反應、細胞外基質(zhì)的破壞與肺纖維化的不良預后有關(guān)，M2型巨噬細胞以旁分泌的形式引起成纖維細胞細胞過度增殖、細胞外基質(zhì)重塑及血管生成［15］，研究證明，在嚙齒類動物博萊霉素模型中，肺巨噬細胞被認為 TGF-β 的主要來源細胞［4］，而TGF-β作為一種主要的促纖維化分子，其在不同器官纖維化病理過程中的作用機制較為明確［16－17］。此外，肺組織巨噬細胞來源的多種趨化因子(如IL-8，CXCL10，CCL5 等)、炎癥因子(IL-1β、TNF-α、IL-6)等細胞因子及其與不同炎性細胞之間的共同作用，引起肺間質(zhì)纖維細胞的過度增殖、細胞外基質(zhì)沉積，逐漸發(fā)展為不可逆的肺間質(zhì)纖維化。我們的實驗結(jié)果與目前Ly6Chi單核細胞亞群在炎癥調(diào)節(jié)中重要作用的結(jié)論相一致，但與博萊霉素誘導肺損傷中，炎癥早期消除以Ly6Chi亞群為主的循環(huán)單核細胞對隨后的纖維化進展無明顯影響的觀點不同［4，13］，我們的結(jié)果表明，與肺組織炎癥細胞滲出、浸潤等病理進程相比，Ly6Chi單核細胞亞群應對肺組織損傷早期迅速升高，且該亞群單核細胞數(shù)量的增加與肺組織炎癥及后期纖維化評分呈明顯正相關(guān)。綜上所述，在博萊霉素A5誘導的小鼠肺纖維化模型中，不同病理生理階段外周血中 Ly6Chi、Ly6Clo單核細胞亞群比例處于動態(tài)變化，早期Ly6Chi單核細胞亞群比例的升高可能與肺組織炎癥反應及后期纖維化程度存在密切的聯(lián)系。進一步的研究將明確肺纖維化模型中循環(huán)及外周組織單核吞噬細胞功能表型的變化特點及相關(guān)關(guān)系，探討以單核吞噬細胞系統(tǒng)為靶點干預肺纖維化的治療策略。

［1］Raghu G，Collard HR，Egan JJ，et al.An official ATS/ERS/JRS/ALAT statement:idiopathic pulmonary fibrosis:evidencebased guidelines for diagnosis and management［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，183(6):788-824.

［2］Nalysnyk L，Cid-Ruzafa J，Rotella P，et al.Incidence and prevalence of idiopathic pulmonary fibrosis:review of the literature［J］.Eur Respir Rev，2012，21(126):355-361.

［3］Todd NW，Luzina IG，Atamas SP.Molecular and cellular mechanisms of pulmonary fibrosis［J］.Fibrogenesis Tissue Repair，2012，5(1):11.

［4］Gibbons MA，MacKinnon AC，Ramachandran P，et al.Ly6Chi monocytes direct alternatively activated profibrotic macrophage regulation of lung fibrosis［J］.Am J Respir Crit Care Med，2011，184(5):569-581.

［5］Gordon S，Taylor PR.Monocyte and macrophage heterogeneity［J］.Nat Rev Immunol，2005，5(12):953-964.

［6］Lakatos HF，Burgess HA，Thatcher TH，et al.Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation［J］.Exp Lung Res，2006，32(5):181-199.

［7］Szapiel SV，Elson NA，F(xiàn)ulmer JD，et al.Bleomycin-induced interstitial pulmonary disease in the nude，athymic mouse［J］.Am Rev Respir Dis，1979，120(4):893.

［8］du Bois RM.Strategies for treating idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Nat Rev Drug Discov，2010，9(2):129-140.

［9］邱 慧，張德平.γ干擾素后期干預對大鼠肺纖維化影響［J］.醫(yī)學研究生學報，2006，19(10):888-891.

［10］Bringardner BD，Baran CP，Eubank TD，et al.The role of inflammation in the pathogenesis of idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Antioxid Redox Signal，2008，10(2):287-301.

［11］Ingersoll MA，Spanbroek R，Lottaz C，et al.Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets［J］.Blood，2010，115(3):e10-e19.

［12］Ramachandran P，Pellicoro A，Vernon MA，et al.Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype，which orchestrates the regression of murine liver fibrosis［J］.Proc Natl Acad Sci，2012，109(46):E3186-E3195.

［13］Savino B，Castor MG，Caronni N，et al.Control of murine Ly6C(high)monocyte traffic and immunosuppressive activities by atypical chemokine receptor D6［J］.Blood，2012，119(22):5250-5260.

［14］Murray PJ，Wynn TA.Protective and pathogenic functions of macrophage subsets［J］.Nat Rev Immunol，2011，11(11):723-737.

［15］Laskin DL，Sunil VR，Gardner CR，et al.Macrophages and tissue injury:agents of defense or destruction?［J］Annu Rev Pharmacol Toxicol，2011，51:267-288.

［16］馬南蘭.結(jié)核性胸膜纖維化發(fā)病機制的研究進展［J］.醫(yī)學研究生學報，2013，26(7):762-765.

［17］陳艷軍，高旭珍，張艷杰.高山紅景天對肝纖維化大鼠Smad3 mRNA表達的影響［J］.醫(yī)學研究生學報，2013，25(12):1242-1246.