miRNA 146a對(duì)軟骨細(xì)胞MMP 13表達(dá)的影響

張清，曹參，鐘航，黃澤宇，楊靜

(四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科，四川 成都 610000)

實(shí)驗(yàn)研究

miRNA 146a對(duì)軟骨細(xì)胞MMP 13表達(dá)的影響

張清，曹參，鐘航，黃澤宇，楊靜*

(四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科，四川 成都 610000)

目的研究在正常軟骨細(xì)胞及中期和晚期骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)軟骨細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)miRNA 146a后基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metallopeptidase 13，MMP 13)的表達(dá)變化規(guī)律。探索miRNA 146a在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展中的作用。方法收集正常人膝關(guān)節(jié)軟骨4 例，骨關(guān)節(jié)炎患者膝關(guān)節(jié)軟骨12 例。骨關(guān)節(jié)炎組又依據(jù)Kellgren-Lawrence的放射學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)分為中期和晚期骨關(guān)節(jié)炎。通過化學(xué)轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染miRNA 146a mimic或miRNA 146a inhibitor于各組軟骨細(xì)胞，測(cè)定上調(diào)或下調(diào)miRNA 146a后，MMP 13蛋白水平表達(dá)的變化。結(jié)果正常人軟骨細(xì)胞中上調(diào)miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平較對(duì)照組及抑制組均出現(xiàn)明顯的上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；下調(diào)miRNA 146a后，MMP 13蛋白水平下降，結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中期OA軟骨細(xì)胞表達(dá)MMP 13水平高于晚期OA軟骨細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中期OA軟骨細(xì)胞上調(diào)miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抑制miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。晚期OA軟骨細(xì)胞上調(diào)miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；晚期OA軟骨細(xì)胞抑制miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論miRNA 146a可調(diào)控軟骨細(xì)胞MMP 13表達(dá)，從而參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展。

骨關(guān)節(jié)炎；miRNA 146a；MMP 13；RNA干擾

近年來，生物醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)真核生物普遍存在miRNAs的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，已成為許多學(xué)科研究的熱點(diǎn)。報(bào)道顯示[3]，miRNA 146a在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)較正常軟骨細(xì)胞升高，特別是在輕度OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)升高尤其明顯，然后又逐漸降低。本研究旨在探討miRNA 146a調(diào)控MMP 13在正常軟骨細(xì)胞及不同階段OA軟骨細(xì)胞中的作用及機(jī)制，對(duì)探尋OA的發(fā)病機(jī)理及為將來基因治療提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 取因外傷行截肢的膝關(guān)節(jié)正常股骨髁軟骨(4 例)，根據(jù)病史、X線片、術(shù)中肉眼觀察、術(shù)后鏡下病理學(xué)排除標(biāo)本退行性變、腫瘤、結(jié)核、感染、類風(fēng)濕炎癥和明顯骨質(zhì)疏松等以及并存免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病等全身性疾病。根據(jù)美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1995年修訂的膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎需行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(total knee arthroplasty，TKA)患者股骨髁軟骨(12 例)，根據(jù)病史、X線片、術(shù)中肉眼觀察、術(shù)后鏡下病理學(xué)等排除膝關(guān)節(jié)其他病變以及并存免疫系統(tǒng)疾病、糖尿病等全身性疾病，并且根據(jù)Kellgren-Lawrence的放射學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)分為中期(3級(jí))OA組6 例和晚期(4級(jí))OA組6 例。收集患者一般資料，其中正常組男性4 例，29～37 歲，平均32.2 歲，左側(cè)1 例，右側(cè)3 例。OA組12 例，男4 例，女8 例，年齡57～85 歲，平均68.1 歲，左側(cè)8 例，右側(cè)4 例。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞培養(yǎng) 用含青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 μg/ mL)的磷酸鹽緩沖液(petal bovine serum，PBS)沖洗從關(guān)節(jié)置換取下的無菌膝關(guān)節(jié)軟骨組織置于無菌培養(yǎng)皿數(shù)次后，將軟骨修剪至1 mm×1 mm×1 mm大小；將3倍體積的胰蛋白酶加入軟骨碎片中，放入恒溫箱，37℃消化下振蕩40 min，棄去上清液，加雙抗的磷酸鹽緩沖液沖洗3次；然后添加三倍體積的Ⅱ型膠原酶消化，37℃恒溫箱振蕩4～6 h后，低溫離心(2 800 r/min，5 min)，棄去上清液，Dulbecco氏培養(yǎng)基(Dulbecoo′s modified eagle medium，DMEM)F12培養(yǎng)液沖洗3次；加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化；將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)(5 mL/瓶)，置于37℃恒溫，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)中使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁生長情況和形態(tài)，待細(xì)胞貼壁后再第一次換液，以后每2～3天換液一次。原代培養(yǎng)細(xì)胞的覆蓋超過瓶子底部面積的80%時(shí)傳代。

1.2.2 轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天，接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞至細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到30%～50%；在含有細(xì)胞的1 500 μL培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中加入miRNA 146a mimic/inhibitor-lipo 2000混合液混勻；培養(yǎng)6 h后，將孔中含mimic/inhibitor-lipo 2000混合液的培養(yǎng)基移去，更換新鮮培養(yǎng)基；將培養(yǎng)板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～97 h。

各組使用的試劑及劑量：對(duì)照組：含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；上調(diào)組：miRNA 146a mimic 2.5μg+Lipo 2000 5 μg+10%的DMEM(L)2 mL；下調(diào)組：miRNA 146a inhibitor 75pmoL+Lipo2000 7.5 μL+10%的DMEM(L)2 mL。

1.2.3 Western-Blot檢測(cè)MMP 13蛋白表達(dá) 每條泳道以40 μg蛋白量上樣，行7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)移將蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入指定的一抗4℃孵育過夜，雜交反應(yīng)。以磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GADPH)為內(nèi)參。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次及以上，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正常軟骨細(xì)胞干擾miRNA 146a后MMP 13的表達(dá)變化 正常人類軟骨細(xì)胞中，上調(diào)miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平較正常及抑制組均出現(xiàn)明顯的上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；抑制miRNA 146a后，MMP 13蛋白水平下降，結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖1)。

圖1 干擾正常軟骨細(xì)胞miRNA 146a后MMP 13變化

2.2 中期和晚期OA軟骨細(xì)胞干擾miRNA 146a后MMP 13的表達(dá)變化 中期OA軟骨細(xì)胞表達(dá)MMP 13水平高于晚期OA軟骨細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中期和晚期OA軟骨細(xì)胞中，上調(diào)miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平出現(xiàn)相應(yīng)的上升，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中期OA軟骨細(xì)胞中，抑制miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平出現(xiàn)相應(yīng)的下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。晚期OA軟骨細(xì)胞中，抑制miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平下降，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且中期OA軟骨細(xì)胞的MMP 13的下降幅度明顯大于晚期OA軟骨細(xì)胞(見圖2～3)。

圖2 上調(diào)中期、晚期OA軟骨細(xì)胞miRNA 146a后MMP 13變化

圖3 下調(diào)中期、晚期OA軟骨細(xì)胞miRNA 146a后MMP 13變化

3 討 論

MMPs是一類廣泛存在于結(jié)締組織中的結(jié)構(gòu)相似、酶活性依賴于Zn2+的蛋白酶超家族，其主要生物活性是降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種基質(zhì)蛋白，此外激活的MMPs還可切除MMPs酶原的前肽使其激活而產(chǎn)生正反饋式放大效應(yīng)。MMPs可以通過直接降解或間接影響其他細(xì)胞因子和炎性因子水平參與ECM的生理和病理重建[4]。MMPs在體內(nèi)的多個(gè)層面受到嚴(yán)格的調(diào)控，其中組織源性基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是組織局部MMPs活性最重要的調(diào)節(jié)因素[5]。在正常情況下，局部MMPs與TIMPs的水平處于平衡狀態(tài)，使軟骨保持正常的結(jié)構(gòu)與功能。MMPs與TIMPs在正常關(guān)節(jié)中的表達(dá)量極低，而在OA患者關(guān)節(jié)軟骨和滑膜中MMPs的表達(dá)明顯升高。OA時(shí)MMPs的表達(dá)明顯升高，造成MMPs與TIMPs之間的平衡失調(diào)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白多糖和彈力纖維、Ⅱ型膠原等降解增加，關(guān)節(jié)軟骨破壞，這是關(guān)節(jié)軟骨退變、進(jìn)而發(fā)生OA的基本環(huán)節(jié)[6]。MMPs在OA發(fā)生發(fā)展中的作用受到廣泛的關(guān)注，其中研究最多的是MMP 13，其對(duì)Ⅱ型膠原的分解能力最強(qiáng)，是其他膠原酶分解強(qiáng)度的10倍[7]，同時(shí)還能分解Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅹ、型膠原和蛋白聚糖，被認(rèn)為是OA軟骨退變的核心因素之一[8]。過表達(dá)MMP 13的老鼠關(guān)節(jié)可出現(xiàn)和OA相同的表現(xiàn)[9]。

Taganov等[10]通過篩查人類單核細(xì)胞中表達(dá)的200多個(gè)miRNAs，得出miRNA 146a/b是內(nèi)毒素響應(yīng)性基因，可為微生物基質(zhì)和前炎癥因子等所誘導(dǎo)。Yamasaki等[3]通過對(duì)OA患者軟骨細(xì)胞miRNA 146a的基因表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 146a在患輕度OA的軟骨細(xì)胞就有很高的表達(dá)，并且miRNA 146a的表達(dá)受白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)的影響。高表達(dá)miRNA146可以減少IL-1β調(diào)控的表達(dá)產(chǎn)物腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)的水平。miRNA 146a與OA疼痛亦相關(guān)，Li[11]等通過構(gòu)建大鼠OA模型，發(fā)現(xiàn)miRNA 146a與OA引起的慢性疼痛相關(guān)，并得出miRNA 146a治療可有效緩解OA疼痛，同時(shí)改善膝關(guān)節(jié)軟骨活性。此外，miRNA 146a也參與了軟骨細(xì)胞凋亡。Smad4通過抑制軟骨細(xì)胞肥大化和細(xì)胞凋亡而在軟骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，miRNA 146a可通過降低軟骨細(xì)胞的Smad4水平從而促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[12]。

miRNA 146a在OA患者的軟骨組織合成代謝和分解代謝中扮演著重要角色，但具體作用仍有爭(zhēng)論。在IL-1β刺激下，軟骨細(xì)胞miRNA 146a表達(dá)水平升高，同時(shí)MMP 13的mRNA水平也升高，二者呈平行上升趨勢(shì)[3]。另有報(bào)道[13]顯示IL-1可明顯降低蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的mRNA水平，同時(shí)升高蛋白聚糖酶5與MMP 13水平，而軟骨細(xì)胞過表達(dá)的miRNA 146a可抵消此IL-1引起的效果，從而降低MMP 13水平。說明miRNA 146a對(duì)軟骨基質(zhì)的代謝具有重要影響。目前miRNA 146a獨(dú)立對(duì)正常及不同階段OA軟骨細(xì)胞MMP 13的影響仍需要進(jìn)一步研究。為了探索miRNA 146a能否通過影響軟骨代謝參與OA進(jìn)程，本次試驗(yàn)通過化學(xué)轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)或抑制正常軟骨細(xì)胞及中期和晚期OA軟骨細(xì)胞miRNA146a后，使用WesternBlot技術(shù)檢測(cè)MMP13水平，以得出miRNA146a能否調(diào)控MMP13水平。

首先，本次實(shí)驗(yàn)得出，中期OA軟骨細(xì)胞表達(dá)MMP 13的水平明顯高于晚期OA軟骨細(xì)胞，這與既往結(jié)果[3]相一致。這可能是因?yàn)橹衅贠A軟骨重建，分泌大量MMP 13加速基質(zhì)降解，而到了OA晚期，軟骨重建基本完成，細(xì)胞外基質(zhì)已大量破壞、降解，MMP 13水平下降。其次，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，中期和晚期OA軟骨細(xì)胞中，上調(diào)或抑制miRNA 146a后，MMP 13的蛋白水平出現(xiàn)相應(yīng)的上升或下降。說明miRNA 146a可通過上調(diào)MMP 13的水平參與軟骨細(xì)胞分解代謝，加速軟骨基質(zhì)降解。最后，抑制miRNA 146a后，中期OA軟骨細(xì)胞MMP 13下降的幅度明顯大于晚期OA軟骨細(xì)胞，提示及早對(duì)OA軟骨細(xì)胞進(jìn)行miRNA 146a干預(yù)可取得更好的效果。而miRNA 146a通過何種途徑影響MMP 13的水平還不清楚，目前已知MMP 13在軟骨細(xì)胞受各種因子的調(diào)節(jié)，其中又以IL-1和TNF最重要，有研究顯示[10]IL-1受體相關(guān)激酶1和TNF受體相關(guān)因子6基因是miRNA 146a體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后的靶點(diǎn)。miRNA 146a是否通過此途徑調(diào)節(jié)MMP 13尚需進(jìn)一步研究。

[1]Pelletier JP，Martel-Pelletier J，Abramson SB.Osteoarthritis，an inflammatory disease：potential implication for the selection of new therapeutic targets[J].Arthritis Rheum，2001，44(6)：1237-1347.

[2]Roach HI，Yamada N，Cheung KS，etal.Association between the abnormal expression of matrix-degrading enzymes by human osteoarthritic chondrocytes and demethylation of specific CpG sites in the promoter regions[J].Arthritis Rheum，2005，52(10)：3110-3112.

[3]Yamasaki K，Nakasa T，Miyaki S，etal.Expression of microRNA‐146a in osteoarthritis cartilage[J].Arthritis & Rheumatism，2009，60(4)：1035-1041.

[4]Mott JD，Werb Z.Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases[J].Curr Opin Cell Biol，2004，16(5)：558-564.

[5]Pufe T，Lemke A，Kurz B，etal.Mechanical overload induces VEGF in cartilage discs via hypoxia-inducible factor[J].The American journal of pathology，2004，164(1)：185-192.

[6]劉江濤，郭雄.骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國骨質(zhì)疏松雜志，2010，16(10)：776-780.

[7]Knauper V，Lopez-Otin C，Smith B，etal.Biochemical characterization of human collagenase-3[J].J Biol Chem，1996，271(3)：1544-1550.

[8]Moldovan F，Pelletier JP，Hambor J，etal.Collagenase-3(matrix metalloprotease 13)is preferentially localized in the deep layer of human arthritic cartilage in situ：in vitro mimicking effect by transforming growth factor beta[J].Arthritis Rheum，1997，40(9)：1653-1661.

[9]Neuhold LA，Killar L，Zhao W，etal.Postnatal expression in hyaline cartilage of constitutively active human collagen ase-3(MMP-13)induces osteoarthritis in mice[J].J Clin Invest，2001，107(1)：35-44.

[10]Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，etal.NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，15，103(33)：12481-12486.

[11]Li X，Kroin J S，Kc R，etal.Altered Spinal MicroRNA‐146a and the MicroRNA‐183 Cluster Contribute to Osteoarthritic Pain in Knee Joints[J].J Bone Mine Res，2013，28(12)：2512-2522.

[12]Li J，Huang J，Dai L，etal.miRNA 146a，an IL-1β responsive miRNA，induces vascular endothelial growth factor and chondrocyte apoptosis by targeting Smad4[J].Arthritis Res Ther，2012，14(2)：75.

[13]Li X，Gibson G，Kim JS，etal.MicroRNA-146a is linked to pain-related pathophysiology of osteoarthritis[J].Gene，2011，480(1-2)：34-41.

ResearchontheMechanismofmiRNA146aRegulatingMMP13intheDegenerativeProcessofOAChondrocyte

ZHANG Qing，CAO Can，ZHONG Hang，etal

(Department of Orthopedics，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610000，China)

ObjectiveTo study the changes of the expression of MMP 13 after up-regulated or down-regulated the miRNA 146a in the normal chondrocytes and the middle and late stage of the OA chondrocytes.To explore the role of miRNA 146a in the development and progression of osteoarthritis.MethodsWe collected 4 cases of normal cartilage and 12 cases of arthritic cartilage which were divided into middle stage and late stage by Kellgren-Lawrence imaging protocol.Chemical transfection was used in every group of chondrocyes.And we studied the changes of MMP 13 after up-regulating or down-regulating the miRNA 146a chondrocytes.ResultsThe protein expression level of MMP 13 turned out to be up after up-regulating the miRNA 146a in the normal chondrocytes.The result is stastically significant.The expression of MMP 13 turned out to be down after down-regulating.The result was not statistically significant.The protein expression of MMP 13 was higher in the middle stage OA chondrocytes than the late OA stage chondrocytes，and the result was statistically significant.The protein expression level of MMP 13 turned out to be up after up-regulating the miRNA 146a in late stage of the OA chondrocytes.The result was statistically significant.The protein expression level of MMP 13 turned out to be down after down-regulating the miRNA 146a in late stage of the OA chondrocytes.The result was stastically significant.ConclusionmiRNA 146a has an effect on the chondrocyte through MMP 13.Thus plays a role in pathology of OA.

osteoarthritis；miRNA 146a；matrix metallopeptidase 13；RNA interference

1008-5572(2014)11-0999-04

Q786

：A

四川省科技廳科技支撐項(xiàng)目(2011FZ0040)；*本文通訊作者：楊靜

2014-07-21

張清(1987- )，男，研究生在讀，四川大學(xué)華西醫(yī)院骨科，610000。

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是由全身易感因素和局部機(jī)械因素相互作用導(dǎo)致的一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹鞯某Ｒ娎夏晷怨桥c關(guān)節(jié)退行性疾病。其主要的臨床表現(xiàn)為：受累關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、畸形、活動(dòng)受限，X線片的主要表現(xiàn)為受累關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化、周圍骨贅形成。目前OA的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，比較統(tǒng)一的解釋是，機(jī)械力學(xué)和生物學(xué)因素導(dǎo)致軟骨細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和軟骨下骨的退化。基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metallopeptidase 13，MMP 13)是軟骨細(xì)胞肥大分化的標(biāo)志物，是導(dǎo)致OA關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解的重要水解酶之一[1]。當(dāng)軟骨受損后，軟骨細(xì)胞MMP 13的表達(dá)量上升[2]，導(dǎo)致了細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生與降解之間的平衡被打破，Ⅱ型膠原被大量降解，軟骨細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境和膠原網(wǎng)絡(luò)遭到了破壞，從而導(dǎo)致了OA的發(fā)生。