三種方法檢驗乙型肝炎血清標(biāo)志物結(jié)果評價

薛芳芳　趙婷婷

[摘 要] 目的：對比酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、電化學(xué)發(fā)光法（ECLIA）及時間分辨熒光分析法（TRFIA）檢驗乙型肝炎血清標(biāo)志物（HBV-M）的結(jié)果，評價三種方法。方法：采集200例乙型肝炎病毒感染者及100名正常體檢者的血清，通過ELISA 法、ECLIA法、TRFIA法分別檢驗HBV-M。以ECLIA為參考，采用Kappa檢驗對不同方法學(xué)檢測結(jié)果間一致性進(jìn)行評價，通過μ檢驗排除抽樣誤差可能造成的影響，通過Kappa系數(shù)大小來判定一致性強弱程度。結(jié)果：ELIAS與ECLIA比較，經(jīng)μ檢驗，所有項目P均<0.05，兩種方法具有一致性；TRFIA與ECLIA比較，經(jīng)μ檢驗，所有項目P均<0.05，兩種方法具有一致性。結(jié)論：三種方法檢驗乙型肝炎血清標(biāo)志物結(jié)果具有高度一致性，可針對不同需要選擇合適檢測方法。

[關(guān)鍵詞] 乙型肝炎病毒；血清學(xué)標(biāo)志物；酶聯(lián)免疫吸附試驗；電化學(xué)發(fā)光法；時間分辨免疫熒光法

中圖分類號：R446.11 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：2095-5200（2014）05-073-03

乙型肝炎病毒（HBV）血清學(xué)標(biāo)記物（HBV-M）[包括乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎表面抗體（抗HBs）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）、乙型肝炎e抗體（抗HBe）、乙型肝炎核心抗體（抗HBc）]檢查是臨床診斷、治療及判斷HBV感染者病程及傳染性的重要指標(biāo)[1]。檢驗HBV-M的方法較多，包括放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，化學(xué)發(fā)光法（CLIA）、電化學(xué)發(fā)光法（ECLIA）、時間分辨免疫熒光法（TRFIA）在臨床實驗室逐漸得到推廣和普及[2]。為了解不同方法的檢驗效果，我們采用ELISA、ECLIA、TRFIA3種方法對HBV-M進(jìn)行檢測，對比不同方法的檢驗結(jié)果，探討檢驗結(jié)果的一致性，為臨床檢驗方法選擇提供參考。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本來源

選擇2012年9月～2013年9月門診及住院患者共200例，所有患者均經(jīng)ECLIA證實為乙型肝炎病毒感染者，其中男121例，女79例，年齡7～59歲，平均年齡30.1±19.2歲，另選擇100名健康體檢患者血清，其中男46例，女54例，年齡20～43歲，平均31.2±9.6歲。

1.2 儀器和試劑

選用意大利ALISEI全自動酶標(biāo)儀，北京萬泰生物工程股份有限公司生產(chǎn)HBV-M試劑盒；美國ABBOTT公司生產(chǎn)的ARCHI TECTi2000自動化免疫分析儀及配套測HBV-M全套試劑，德國Roche 公司生產(chǎn)的Elecsys 2010自動化免疫分析儀及配套測HBV-M全套試劑。

1.3 方法

ELISA檢測結(jié)果判定按廠家試劑說明書規(guī)定之Cut-off值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，夾心法檢測結(jié)果以>Cut-off值為陽性，競爭法檢測結(jié)果以

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Kappa檢驗對三種檢測方法結(jié)果的一致性進(jìn)行判斷，通過μ檢驗排除抽樣誤差可能造成的影響，以Kappa系數(shù)大小來判定一致性強弱程度，如：Kappa系數(shù)<0為差度一致性，0～0.2為微弱度一致性，0.21～0.4為弱度一致性，0.41～0.6為中度一致性，0.61～0.8為高度一致性；0.81～1.0為極強度一致性。

2 結(jié)果

3 討論

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，全球無癥狀乙肝病毒攜帶者約2.8億，僅我國患者就有1.3億，乙肝病毒感染所致的乙型病毒性肝炎已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的重要傳染性疾病。臨床檢驗中檢測乙型肝炎血清標(biāo)志物的方法較多，按照檢測技術(shù)不同可大致分為定性檢測和定量檢測兩大類。前者包括金標(biāo)法和ELISA，后者包括CLIA、ECLIA、TRFIA等[3-4]。而檢測結(jié)果的有效報告是指導(dǎo)臨床診斷治療的重要環(huán)節(jié)，是檢驗界結(jié)果互認(rèn)的重要依據(jù)，故及其有必要對各檢驗方法結(jié)果一致性進(jìn)行評價及比較[5-6]。通常定性測定主要應(yīng)用于普通人群及乙肝患者進(jìn)行的乙肝血清標(biāo)志物檢測，常以ELISA法為主[7]。此種檢測方法操作簡單，經(jīng)濟實惠，通過在檢測過程中直接進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)量化質(zhì)控，保證了檢測結(jié)果的相對有效性[8-10]。ECLIA是結(jié)合生物素及鏈霉親和素參與反應(yīng)的方法，將釕作為標(biāo)記物，通過測定光電信號對結(jié)果進(jìn)行判定，敏感度相對增高[11-12]。既往研究認(rèn)為，ECLIA相比ELISA法主要優(yōu)勢在于方法簡便、自動快速、檢測結(jié)果特異性強、敏感度高，結(jié)果可定量，最重要的在于檢測時期分析敏感性為0.09ng/mL，最高濃度可達(dá)150萬IU/mL而不會出現(xiàn)前帶現(xiàn)象[13-15]。TRFIA法屬于新型熒光免疫標(biāo)記技術(shù)，其以鑭系元素為標(biāo)記物，相比傳統(tǒng)異硫氰酸熒光素所標(biāo)記的熒光免疫分析，TRFIA法避免了因激發(fā)光譜和發(fā)射光譜由位移較小所指的部分重疊現(xiàn)象，降低了測量干擾程度。在正常情況下，其標(biāo)記物銪可發(fā)出的信號極其微弱，當(dāng)由外部加入某種酸性增強液后，免疫復(fù)合物中的銪就可以順利解離出，并再次形成新的螯合物，由激發(fā)光激發(fā)后便可產(chǎn)生非常強的熒光信號。由于TRFIA法是兩步法，儀器全自動檢測，實驗條件平穩(wěn)可靠，最大程度降低了主客觀因素造成的誤差，大大降低了誤診率[16-18]。

本研究中，對比ELISA法和ECLIA法可見，兩者在HBeAg項目上表現(xiàn)出極強一致性，其余項目則為高度一致性。有研究認(rèn)為ELISA法在判斷結(jié)果時因存在檢測灰區(qū)而影響部分結(jié)果誤讀，故對結(jié)果要求嚴(yán)格的術(shù)前檢查不宜采用此法。原因在于該法通過酶進(jìn)行檢測，對反應(yīng)后試劑顏色深淺用以判斷實驗結(jié)果，而抗原或抗體若同酶結(jié)合物的濃度較低時，由于反映出的吸光度值太小，故假陰性率較高，而當(dāng)濃度較大時，吸光度值則變大，嚴(yán)重情況下可超出曲線敏感范圍平臺，檢驗結(jié)果準(zhǔn)確性難以完全保證[19-21]。如本研究中在臨床最關(guān)注的HBsAg項目上ELISA法有18例漏檢，說明其敏感度的確不足。不過對于普通人群疾病篩查使用該手段較好，畢竟其費用低、操作簡單快速等優(yōu)點是其他檢測方法無法比擬的。

TRFIA法檢測結(jié)果同ECLIA法在抗HBs項目上具有高度一致性，在其他項目上則具有極強一致性，同既往研究結(jié)果類似[3]。正常人檢測時出現(xiàn)8例HBsAg結(jié)果差異，提示兩種方法在特異度上存在區(qū)別。有研究報道，相比ELISA法，TRFIA法檢出陽性率高，可定量檢測、特異性及靈敏度均較高，在檢驗醫(yī)學(xué)中具有廣闊發(fā)展?jié)摿22-23]。原因在于TRFIA采用波長和時間兩種分辨技術(shù)，通過時間延長，將非特異熒光干擾清除，并于固定時間對特異熒光檢測，使自然背景干擾問題得到了解決，靈敏度極大增加；同時激發(fā)光同發(fā)射光間的Stokes移位較大，便于對兩種光波長進(jìn)行分別，非特異熒光干擾得到排除，光譜分辨率明顯提高，增強了檢測結(jié)果特異度[24-26]。ECLIA法可用于對診斷明確的乙型肝炎患者治療后療效進(jìn)行判斷，，TRFIA法具有檢測病毒變異的能力，在其他檢測手段難以確定時用處更大[27-28]，其通過定量結(jié)果的回歸分析，可對溯源一致的項目進(jìn)行一致性程度評價，結(jié)合基因檢測手段，還可對處于病毒復(fù)制期與可能發(fā)生病毒變異的患者進(jìn)行相關(guān)性分析，體現(xiàn)出該檢測手段的臨床價值所在。

總之，幾種HBV-M檢測手段檢測結(jié)果具有較高一致性，可針對不同需要選擇合適檢測方法。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 李云，夏正武，瞿良. 乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物與 HBV DNA 的相關(guān)性分析[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（4）： 442-443.

[2] 陳莉，李緒黎. 兩種方法檢測乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物的比較[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2010，（4）： 377-378.

[3] 楊凡，單詠梅，周宏，等. 不同方法學(xué)檢測乙型肝炎血清標(biāo)志物結(jié)果的評價分析[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2010，25（9）： 723-726.

[4] 魏桂芬，丘文慧，張宇平. 乙型肝炎血清標(biāo)志物四種檢測方法的對比分析[J]. 海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2012，18（4）： 498-500.

[5] 陳桂山，張秀明，熊繼紅，等. 酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測乙肝表面抗原的分析性能評價[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（9）： 932-933.

[6] 吳斌，李彩東，李惠軍，等. 兩種國產(chǎn)乙型肝炎病毒核酸定量試劑盒檢測結(jié)果分析[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（14）： 1880-1881.

[7] 李艷霞. 時間分辨熒光免疫分析和酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物結(jié)果分析[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（11）： 1218-1219.

[8] 孫煥英，遲珊，談春榮. 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物五項的結(jié)果模式分析[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，35（005）： 472-474.

[9] Bhalerao A G，Joshi A R，Kulkarni A S，et al. Comparative Study of ELISA and LATEX Agglutination Tests in Detecting HBsAg in Voluntary Blood Donors[J]. Indian Medical Gazette，2012，321.

[10] Costa C I，Delgado I F，Da Costa J A C，et al. Establishment and validation of an ELISA for the quantitation of HBsAg in recombinant hepatitis B vaccines[J]. Journal of virological methods，2011，172（1）： 32-37.

[11] Seo D H，Whang D H，Song E Y，et al. Prevalence of antibodies to hepatitis B core antigen and occult hepatitis B virus infections in Korean blood donors[J]. Transfusion，2011，51（8）： 1840-1846.

[12] Minekawa T，Takehara S，Takahashi M，et al. Development of a Highly Sensitive Bioluminescent Enzyme Immunoassay for Hepatitis B Virus Surface Antigen Capable of Detecting Divergent Mutants[J]. Clinical and Vaccine Immunology，2013，20（8）： 1255-1265.

[13] 盧桂香. 不同方法學(xué)檢測乙型肝炎血清標(biāo)志物結(jié)果評價[J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2012，18（8）： 152-153.

[14] 徐克，池勝英，吳麗芳，等. 電化學(xué)發(fā)光法測定 10409 例乙型肝炎病毒標(biāo)志物的結(jié)果分析[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)，2011，26（10）： 700-702.

[15] 江雁瓊，遲瓊，詹鈾超. 基于不同檢測方法的乙型肝炎病毒感染血清標(biāo)志物模式分析[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2013，10（9）： 1071-1073.

[16] 趙樹波，方艷秋，邢國燕，等. 時間分辨熒光免疫法定量檢測乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物的應(yīng)用價值[J]. 吉林醫(yī)學(xué)，2013，33（32）： 6966-6967.

[17] 胡志剛，劉潔，陳國千，等. 時間分辨免疫熒光定量檢測乙型肝炎病毒前 S1 抗原的研究[J]. 中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，29（5）： 407-410.

[18] 吳艾霖，龔國民. 時間分辨熒光免疫分析定量檢測乙型肝炎病毒五項指標(biāo)的臨床評價[J]. 西南軍醫(yī)，2010，12（2）： 293-294.

[19] 謝璟，崔江龍，王宏碧，等. ELISA 法對乙肝六項檢測結(jié)果的影響及處理對策[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2011，29（1）： 83-84.

[20] 吳玉紅. ELISA 法檢測 HBsAg 出現(xiàn)假陽性的原因探討[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，（19）： 81-82.

[21] 薛春楊，周建波. ELISA 法乙肝兩對半檢測影響因素分析和臨床意義[J]. 中國誤診學(xué)雜志，2011，11（16）： 3913-3914.

[22] 肖義森，潘國基，徐麗潔，等. TRFIA 和 ELISA 檢測乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物的比較[J]. 實驗與檢驗醫(yī)學(xué)，2010，28（1）： 53-54.

[23] 蔡惠興，吳英，梁鵬. 乙肝血清標(biāo)志物與 HBV—DNA 定量檢測結(jié)果分析[J]. 國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報，2010，（2）： 218-219.

[24] 崔曼曼，龔連生. 兩種方法測定乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物的結(jié)果分析[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（008）： 1750-1751.

[25] 覃小梅，曾顯媛，秦麗容. 時間分辨熒光免疫法定量檢測乙肝病毒血清標(biāo)志物的臨床意義[J]. 臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，10（10）： 775-776.

[26] de la Escosura-Mu?iz A，Maltez-da Costa M，Sánchez-Espinel C，et al. Gold nanoparticle-based electrochemical magnetoimmunosensor for rapid detection of anti-hepatitis B virus antibodies in human serum[J]. Biosensors and Bioelectronics，2010，26（4）： 1710-1714.

[27] 張少華. 乙型肝炎病毒前 S1 抗原及乙肝病毒血清標(biāo)志物的檢測結(jié)果分析[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，（13）： 2068-2069.

[28] 漆愛紅. 乙型肝炎血清標(biāo)志物定量檢測與 HBV-DNA 定量檢測的相關(guān)性及臨床意義[J]. 西部醫(yī)學(xué)，2012，24（5）： 987-991.