甘肅不同產(chǎn)區(qū)紅芪中指標(biāo)性成分含量的比較△

李成義，王燕，強正澤，楊建成，王明偉

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

甘肅不同產(chǎn)區(qū)紅芪中指標(biāo)性成分含量的比較△

李成義，王燕，強正澤，楊建成，王明偉*

(甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000)

目的：采用高效液相色譜法，測定甘肅不同產(chǎn)區(qū)紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量，對產(chǎn)區(qū)與指標(biāo)性成分的相關(guān)性進(jìn)行研究。方法：色譜柱為TC-C18(2)柱(250mm×4.6mm，5μm)，TC-C18保護(hù)柱(10mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈-0.01%磷酸水溶液(梯度洗脫)，流速為1.0mL·min-1，檢測波長為248nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：經(jīng)系統(tǒng)聚類分析方法分析，采自隴南市和定西市的16批樣品可分為三大類，其中采自隴南市武都區(qū)、宕昌縣的9個產(chǎn)地的紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量較高，芒柄花素含量在111.72～424.92μg·g-1，毛蕊異黃酮含量在17.20～34.34μg·g-1；而采自定西市岷縣、隴西縣和宕昌縣部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)的紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量較低，芒柄花素含量在74.35～182.88μg·g-1，毛蕊異黃酮含量在2.27～13.56μg·g-1。結(jié)論：不同產(chǎn)區(qū)紅芪藥材中指標(biāo)性成分毛蕊異黃酮和芒柄花素含量存在一定的差異。武都、宕昌產(chǎn)紅芪質(zhì)量優(yōu)于岷縣、隴西等地所產(chǎn)紅芪藥材，這與武都、宕昌為紅芪道地產(chǎn)區(qū)一致，可為紅芪GAP種植基地的選址提供參考依據(jù)。

紅芪；毛蕊異黃酮；芒柄花素；HPLC-DAD；聚類分析

紅芪又名綿芪、獨根、黑芪，為甘肅主產(chǎn)特色藥材之一，來源于豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.[1]的干燥根。紅芪始載于梁代陶弘景所撰的《神農(nóng)本草經(jīng)集注》，書中提到：“又有赤色者，可作膏貼，俗方多用，道家不須”[2]。紅芪，其性微溫，味甘，入肺、脾經(jīng)，具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血，行滯通痹，托毒排膿，斂瘡生肌的功能。紅芪在中醫(yī)臨床上常作為補益藥與其他中藥配伍使用，用于治療氣虛引起的各種病癥[3]。本研究以甘肅不同產(chǎn)地紅芪為研究對象，通過對其指標(biāo)性成分毛蕊異黃酮和芒柄花素的測定，研究紅芪的指標(biāo)性成分與產(chǎn)地的相關(guān)性，為紅芪規(guī)范化種植基地的選擇提供參考和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器

Agilent1200型高效液相色譜儀(安捷倫公司)；DAD檢測器(美國)；AL104型電子天平[萬分之一，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；OHAUSCorporationDVSERIES型電子天平(十萬分之一，奧豪斯儀器有限責(zé)任公司)；DJ-02型中藥粉碎機(上海淀久中藥機械制造有限公司)；HHS-4S型電熱恒溫水浴鍋(上海宜昌儀器紗篩廠)；KQ-250TDB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2材料

毛蕊異黃酮對照品、芒柄花素對照品(成都曼思特生物科技有限公司，批號分別為MUST-13030602，MUST-13050801，純度均為99%)；乙腈(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，色譜純)；甲醇(天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠，分析純)；磷酸(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司，優(yōu)級純)；水(娃哈哈純凈水)。

實驗所用16批紅芪藥材樣品分別采自甘肅省隴南市武都區(qū)、宕昌縣和定西市岷縣、隴西縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院楊扶德教授鑒定均為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

TC-C18(2)色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)，TC-C18保護(hù)柱(10mm×4.6mm，5μm)，流動相為乙腈-0.01%磷酸水溶液，梯度洗脫(0～25min，30%～33%B；25～45min，33%～36%B)，流速為1.0mL·min-1，檢測波長為248nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。在此色譜條件下色譜圖分離度良好，見圖1。

A.供試品 B.對照品1.毛蕊異黃酮 2.芒柄花素圖1 紅芪藥材及對照品HPLC圖

2.2溶液的配制

2.2.1混合對照品溶液的配制 分別精密稱取毛蕊異黃酮和芒柄花素對照品1.13，4.05mg，分別置于10mL量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容于10mL量瓶中，作為對照品貯備液A、B。分別精密吸取這兩種對照品貯備液2mL，用甲醇定容至10mL，制成混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的配制 精密稱取紅芪藥材樣品粉末3.0000g，置150mL錐形瓶中，加入甲醇30mL，于80℃水浴回流提取1h，過濾，濾液減壓回收甲醇，至一定量后再以適量甲醇定容至10mL量瓶中，進(jìn)樣前以0.45μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液[4]。

2.3線性關(guān)系考察

分別精密吸取一定量的混合對照品溶液，將其制成8個系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液，其中毛蕊異黃酮質(zhì)量濃度為0.226，0.452，2.260，11.300，22.600，33.900，45.200，61.020μg·mL-1，芒柄花素質(zhì)量濃度為0.810，1.620，8.100，40.500，81.000，121.500，162.000，218.700μg·mL-1，進(jìn)樣10μL，測定。以質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得毛蕊異黃酮回歸方程Y=39.538X-0.1456，r=0.9999，結(jié)果表明毛蕊異黃酮在0.226～61.020μg·mL-1線性關(guān)系良好；得芒柄花素回歸方程Y=60.769X-9.0639，r=0.9999，結(jié)果表明芒柄花素在0.810～218.700μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.4精密度試驗

精密吸取2.2.1項下所制毛蕊異黃酮和芒柄花素的混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按2.1項下色譜條件測定峰面積，結(jié)果毛蕊異黃酮和芒柄花素峰面積積分值的RSD分別為0.05%、0.04%，表明儀器精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗

取同一產(chǎn)地的紅芪供試品溶液(隴西首陽)，于室溫下放置，分別于0，4，8，12，20，24h進(jìn)樣檢測，按毛蕊異黃酮和芒柄花素的峰面積積分值計算RSD，分別為2.65%，0.72%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6重復(fù)性試驗

取同一產(chǎn)地的紅芪樣品粉末(隴西首陽)，精密稱取樣品6份，按2.2.2項下方法制成6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別測定，結(jié)果該樣品中毛蕊異黃酮和芒柄花素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.50%，0.76%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率試驗

精密稱定已知毛蕊異黃酮和芒柄花素含量的同一產(chǎn)地的紅芪樣品(隴西首陽)9份，每份約1.0g，精密加入一定量的毛蕊異黃酮和芒柄花素對照品，其加入量分別為該樣品中相應(yīng)成分含量的80%(10.17，222.75μg)、100%(14.69，263.25μg)、120%(18.08，303.75μg)，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，結(jié)果毛蕊異黃酮和芒柄花素回收率的RSD分別為2.76%，2.52%。

2.8 不同產(chǎn)地樣品中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量測定

16批紅芪藥材樣品的供試品溶液均按2.2.2項下方法制備，按2.1項下所述色譜條件進(jìn)行測定，分別記錄毛蕊異黃酮和芒柄花素相應(yīng)色譜峰的峰面積，然后將色譜峰峰面積代入相應(yīng)的回歸方程，計算不同產(chǎn)地紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表1。

表1 不同產(chǎn)地紅芪藥材中毛蕊異黃酮、芒柄花素的測定 /μg·g-1

2.9聚類分析

此分析方法對所得數(shù)據(jù)采用Z-Score法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，用歐氏距離平方法(SquaredEuclideandistance)計算樣品間相似性程度，選用組間平均距離連接法(Between-groupsLinkage)進(jìn)行聚類，分析結(jié)果見圖2。

圖2 甘肅不同產(chǎn)區(qū)紅芪聚類分析樹狀圖

3 討論

從表1可以看出，采自武都、宕昌9批紅芪中芒柄花素和毛蕊異黃酮的含量均高于岷縣和隴西縣所產(chǎn)紅芪。其中分布于米倉山一帶的武都安化鎮(zhèn)和魚龍鎮(zhèn)所產(chǎn)紅芪藥材中2個異黃酮類成分的含量相對較高，這進(jìn)一步詮釋了道地藥材“米倉紅芪”的內(nèi)在意義。

通過實驗數(shù)據(jù)分析及相應(yīng)的方法學(xué)考察，結(jié)果表明所采用的同時測定紅芪藥材中兩種化合物含量的檢測方法簡便、可靠、準(zhǔn)確，且具有一定的實用性，可用于紅芪藥材樣品的質(zhì)量控制。

采用SPSS13.0軟件中系統(tǒng)聚類分析法[5-6]，以紅芪藥材中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量為考察指標(biāo)，對16個產(chǎn)地的紅芪藥材樣品進(jìn)行了化學(xué)模式識別研究。分析結(jié)果顯示，不同產(chǎn)區(qū)紅芪藥材中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量存在一定的差異。采自隴南市和定西市的16批樣品可分為三大類，其中采自隴南市武都區(qū)、宕昌縣9個產(chǎn)地的紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素的含量較高，芒柄花素含量在111.72～424.92μg·g-1，毛蕊異黃酮含量在17.20～34.34μg·g-1，可以認(rèn)為這幾個產(chǎn)地紅芪品質(zhì)較優(yōu)；而采自定西市岷縣、隴西縣和宕昌縣部分地區(qū)的紅芪中毛蕊異黃酮和芒柄花素含量較低，芒柄花素含量在74.35～182.88μg·g-1，毛蕊異黃酮含量在2.27～13.56μg·g-1，其紅芪品質(zhì)較差。總體而言，產(chǎn)自武都、宕昌的紅芪品質(zhì)優(yōu)于岷縣、隴西產(chǎn)紅芪，這與武都、宕昌為紅芪道地產(chǎn)區(qū)一致，可為紅芪GAP種植基地的選址提供參考依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：142.

[2] 李時珍.本草綱目[M].校點本.第二冊.北京：人民衛(wèi)生出版社，1979：696.

[3] 權(quán)菊香.紅芪的藥理研究進(jìn)展[J].時珍國藥研究，1997，8(2)：178-180.

[4] 梁麗娟，趙奎君，屠鵬飛，等.HPLC法同時測定黃芪中4種黃酮類成分的含量[J].中國藥房，2010，21(15)：1385-1387.

[5] 李輝，葉青.不同產(chǎn)地北柴胡質(zhì)量的化學(xué)模式識別研究[J].中國藥師，2005，8(3)：214-215.

[6] 董海榮，王睿，趙卉，等.不同產(chǎn)地苦杏仁質(zhì)量的化學(xué)模式識別研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2009，36(12)：2147-2149.

ComparativeStudyAboutContentsofMarkComponentsinHedysariRadixfromDifferentHabitatsinGansuProvince

LI Chengyi，WANG Yan，QIANG Zhengze，YANG Jiancheng，WANG Mingwei*

(Gansu College of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China)

Objective：To determine the contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix from different habitats by HPLC and explore the correlation between production areas and mark components.Methods：The sample was separated on TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm，5 μm)column.The mobile phase consisted of acetonitrile and 0.01% phosphoric acid solution(gradient elution)at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The UV detection wave length was set at 248 nm.The column temperature was set at 30 ℃.The injection volume was set at 10 μL.Results：The 16 samples from different habitats were divided into 3 categories according to the result of hierarchical cluster analysis.The content of formononetin in Hedysari Radix from Wudu and Tanchang was between 111.72～424.92 μg·g-1，and calycosin between 17.20～34.34 μg·g-1；The content of formononetin in Hedysari Radix from Minxian and Longxi was between 74.35～182.88 μg·g-1，and calycosin between 2.27～13.56 μg·g-1.Conclusion：The contents of calycosin and formononetin in Hedysari Radix from different habitats marked difference.It was found that those Hedysari Radix produced in Wudu and Tanchang are higher quality than those in Minxian and Longxi，which was consistent with the idea that Wudu and Tanchang were the genuine producing area of Hedysari Radix，and it can provide reference for establishing GAP base of Hedysari Radix.

Hedysari Radix；Calycosin；Formononetin；HPLC-DAD；Hierarchical cluster analysis

國家自然科學(xué)基金委員會資助項目(地區(qū)科學(xué)基金項目)——甘肅地產(chǎn)藥材紅芪道地性與生態(tài)因子的相關(guān)性研究(81360621)

*

王明偉，講師，研究方向：中藥品種與質(zhì)量研究；Tel：(0931)8765390，E-mail：wmw2009@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.10.004

2014-07-01)