升血調(diào)元顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

袁春平，林碧珊，吳潔瑩，黃掌欣

(廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 順德 528303)

升血調(diào)元顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

袁春平，林碧珊，吳潔瑩，黃掌欣*

(廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東 順德 528303)

目的：建立升血調(diào)元顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對(duì)制劑中骨碎補(bǔ)、制何首烏、黃芪及佛手進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法對(duì)制劑中柚皮苷進(jìn)行含量測定。結(jié)果：樣品薄層色譜中，骨碎補(bǔ)、制何首烏、黃芪及佛手的薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離效果較好，且陰性無干擾；含量測定中柚皮苷在0.12～1.2 μg呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)，平均回收率為100.47%，RSD=1.6%(n=5)。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)方法結(jié)果準(zhǔn)確可行，重復(fù)性好，可作為升血調(diào)元顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為該制劑的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)提升提供科學(xué)依據(jù)。

升血調(diào)元顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法

升血調(diào)元顆粒是在升血調(diào)元湯的基礎(chǔ)上更改劑型而來，升血調(diào)元湯收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第七冊(cè)，是由雞血藤、骨碎補(bǔ)、制何首烏、黃芪、麥芽、女貞子、黨參、佛手8味中藥組成，具有益氣養(yǎng)血，補(bǔ)腎健脾的功能，其中黨參、黃芪具有補(bǔ)氣健脾的功效；骨碎補(bǔ)、何首烏補(bǔ)腎益髓；雞血藤、女貞子滋陰補(bǔ)血；麥芽、佛手起健脾、舒肝、和胃之效。升血調(diào)元顆粒能明顯促進(jìn)BMT小鼠的骨髓造血干細(xì)胞數(shù)量的恢復(fù)和免疫功能的重建，臨床上主要用于提升外周血白細(xì)胞和其他原因引起的白細(xì)胞減少癥及病后虛弱[1]。原方升血調(diào)元湯僅對(duì)何首烏藥材進(jìn)行了TLC定性鑒別，并采用有毒試劑苯作展開劑，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)水平較低，干擾大，可控性不強(qiáng)，為有效控制升血調(diào)元顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，減少有毒試劑的使用，本實(shí)驗(yàn)采用TLC對(duì)方中骨碎補(bǔ)、制何首烏、黃芪及佛手進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜法測定其柚皮苷的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZF-90型暗箱式紫外透射儀，Agileng1100高效液相色譜儀，G1314A-VWD檢測器(美國惠普公司)，Sartorius BP221S型萬分之一電子天平(德國)，MS105DU型十萬分之一電子天平(德國)，SK250H型超聲清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)，101-A電熱鼓風(fēng)烘箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)，876-1真空干燥箱(南通科學(xué)儀器廠)。

1.2 試藥

黃芪對(duì)照藥材(批號(hào)：120974-200609，供鑒別用)、黃芪甲苷對(duì)照品(批號(hào)：110781-200613，供鑒別用)、制何首烏對(duì)照藥材(批號(hào)：120934-200608，121454-200703，供鑒別用)、佛手對(duì)照藥材(批號(hào)：120933-200303，供鑒別用)、骨碎補(bǔ)對(duì)照藥材(批號(hào)：121669-200302，供鑒別用)、柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)：110722-200610，供鑒別及含量測定用)，均購自中國食品藥品檢定研究院；含量測定用甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

升血調(diào)元顆粒(廣東環(huán)球制藥有限公司，規(guī)格：5 g/袋，批號(hào)：100901，101001，101002，081001，081002，081003，0201025，0201028，0201030，0201101，0201104，0201106，0201108，0201122，0201125，0201127)。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別2.1.1 骨碎補(bǔ)的鑒別[2-4]取本品10 g，研細(xì)，加甲醇40 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用三氯甲烷洗滌兩次，每次20 mL，棄去三氯甲烷液，水液用乙酸乙酯提取兩次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。取不含骨碎補(bǔ)藥材的樣品10 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取骨碎補(bǔ)對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液，再取柚皮苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(1∶12∶2.5∶3)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品無干擾。見圖1。

1.缺骨碎補(bǔ)陰性樣品 2.柚皮苷對(duì)照品 3.骨碎補(bǔ)對(duì)照藥材 4～6.供試品(批號(hào)：100901，101001，101002)圖1 升血調(diào)元顆粒中骨碎補(bǔ)TLC圖

2.1.2 制何首烏的鑒別[2，5-7]取本品10 g，研細(xì)，加水30 mL，超聲處理10 min，移入離心管中離心分離，傾取上清液，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取兩次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，回收三氯甲烷，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含何首烏的樣品10 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取制何首烏對(duì)照藥材2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%氫氧化鉀乙醇溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品無干擾。見圖2。

1～3.供試品(批號(hào)：081001，081002，081003) 4.制何首烏對(duì)照藥材 5.缺何首烏陰性樣品圖2 升血調(diào)元顆粒中制何首烏TLC圖

2.1.3 黃芪的鑒別[2，8-11]取本品10 g，研細(xì)，加甲醇20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液加在中性氧化鋁柱(100～200目，5 g，內(nèi)徑為10～15 mm)上，用40 %甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗滌2次，每次20 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?.5 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含黃芪的樣品10 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取黃芪對(duì)照藥材1 g，同法制成黃芪對(duì)照藥材溶液，再取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含黃芪甲苷1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水(1∶10∶2.5∶3)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品無干擾。見圖3。

1.缺黃芪陰性樣品 2.黃芪甲苷對(duì)照品 3.黃芪對(duì)照藥材 4～6.供試品(批號(hào)：100901，101001，101002)圖3 升血調(diào)元顆粒中黃芪TLC圖

2.1.4 佛手的鑒別[2，12-14]取本品10 g，研細(xì)，加水30 mL，超聲處理10 min，移入離心管中離心分離，傾取上清液，置分液漏斗中，用三氯甲烷提取兩次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，回收三氯甲烷，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取不含佛手的樣品10 g，同法制成陰性對(duì)照溶液。另取佛手對(duì)照藥材0.5 g，加水30 mL，回流30 min，離心取上清液，用三氯甲烷提取兩次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，回收三氯甲烷，殘?jiān)訜o水乙醇1 mL使溶解，制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄Ⅵ B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品無干擾。見圖4。

1.缺佛手陰性樣品 2.佛手對(duì)照藥材 3～5.供試品(批號(hào)：100901，101001，101002)圖4 升血調(diào)元顆粒中佛手TLC圖

2.2 柚皮苷含量測定[2，15-16]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取110 ℃干燥至恒重的柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷60 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品適量，研細(xì)，取0.3 g，精密稱定，加入甲醇20 mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置25 mL量瓶中，用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按照處方量制得不含骨碎補(bǔ)的陰性樣品，按供試品溶液制備方法，同法制成陰性對(duì)照樣品溶液。

2.2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-醋酸(38∶62∶1.55)為流動(dòng)相；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；檢測波長：283 nm；進(jìn)樣量：20 μL；理論塔板數(shù)按柚皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500。精密吸取供試品溶液及柚皮苷對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，色譜圖見圖5～7。

圖5 柚皮苷對(duì)照品HPLC圖

圖6 升血調(diào)元顆粒樣品HPLC圖(批號(hào)：081001)

圖7 缺骨碎補(bǔ)陰性樣品HPLC圖

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取柚皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含60 μg的溶液，分別精密吸取2，4，6，10，20 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.000 6X-0.001 2，r=0.999 9。結(jié)果表明柚皮苷含量在0.12～1.2 μg具有良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取柚皮苷對(duì)照品溶液適量，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測定柚皮苷峰面積，計(jì)算其RSD=0.87%(n=5)，表明該測定方法精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取升血調(diào)元顆粒供試品溶液(081001)，依含量測定方法分別在0，2，4，6，8 h測定其柚皮苷含量。結(jié)果5次測定柚皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.65%，0.66%，0.67%，0.66%，0.65%，RSD=1.26%。結(jié)果表明，樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取升血調(diào)元顆粒樣品(081001)，按2.2.2方法制備供試品溶液，共6份，依含量測定方法測定其柚皮苷含量。結(jié)果6份樣品中柚皮苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.42%，RSD=0.82%。結(jié)果表明，該測定方法重復(fù)性良好。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 取已知柚皮苷含量的升血調(diào)元顆粒適量(081001)，研細(xì)，精密稱定，平行5份，分別精密加入柚皮苷對(duì)照品溶液(0.257 1 mg·mL-1)2 mL，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該含量測定方法的加樣回收率符合要求。

表1 升血調(diào)元顆粒中柚皮苷回收試驗(yàn)

注：柚皮苷對(duì)照品加入量均為0.514 1 mg

2.2.10 樣品含量測定 取10批升血調(diào)元顆粒，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取不同批號(hào)的供試品溶液及柚皮苷對(duì)照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，照高效液相色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥD)測定，結(jié)果見表2。

表2 10批升血調(diào)元顆粒樣品中柚皮苷的測定 mg/袋

3 討論

升血調(diào)元顆粒具有益氣養(yǎng)血，補(bǔ)腎健脾的功效。臨床上主要用于提升外周血白細(xì)胞和其他原因引起的白細(xì)胞減少癥及病后虛弱。建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可有效控制藥品的質(zhì)量，是品質(zhì)均一的一項(xiàng)重要指標(biāo)。

升血調(diào)元顆粒系從經(jīng)典名方升血調(diào)元湯改變劑型而來，筆者對(duì)方中8味中藥均進(jìn)行了薄層鑒別研究，但由于黨參的鑒別在后續(xù)重現(xiàn)性試驗(yàn)中出現(xiàn)沒有斑點(diǎn)的情況，方法重現(xiàn)性差；女貞子鑒別實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在供試品色譜中與齊墩果酸對(duì)應(yīng)位置上的斑點(diǎn)不清晰，方法靈敏度不高；以芒柄花素為檢出對(duì)象進(jìn)行雞血藤的鑒別，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陰性樣品有明顯的干擾，原因是方中黃芪也含有芒柄花素，方法不專屬。麥芽在方中起和胃作用，為佐使藥，進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究意義不大；因此以上藥味均未列入制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。

原方升血調(diào)元湯中薄層鑒別采用的展開劑含苯，筆者用低毒的甲苯代替苯進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用甲苯取代苯作展開劑得到的薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好，與用苯作展開劑差異不大。

升血調(diào)元顆粒中，骨碎補(bǔ)為君藥，而柚皮苷又是骨碎補(bǔ)中具有代表性的活性成分，因此筆者將其作為指標(biāo)性成分，對(duì)骨碎補(bǔ)進(jìn)行定量分析，并經(jīng)反復(fù)摸索，確定供試品溶液的制備方法及色譜條件。結(jié)果顯示，樣品的平均回收率為100.47%，RSD=1.6%(n=5)。該方法專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可作為升血調(diào)元顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

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StudyonQualityStandardofShengxueTiaoyuanGranule

YUAN Chunping，LIN Bishan，WU Jieying，HUANG Zhangxin*

(Medi-worldPharmaceuticalCo.Ltd，Shunde528303，China)

Objective：Establish the quality standard of Shengxue Tiaoyuan Granule.Methods：The qualitative identification of Drynariae Rhizoma，Polygoni Multiflori Preparata Radix，Astragali Radix and Citri Sarcodactylis Fructus were carried out by TLC，the content of naringin was determined by HPLC.Results：In TLC chromatography，the spots of Drynariae Rhizoma，Polygoni Multiflori Preparata Radix，Astragali Radix and Citri Sarcodactylis Fructus were clear and had good reproducibility.In the content determination experiments，naringin had a good linear relationship in 0.12-1.2 μg (r=0.999 9).The average recovery of naringin is 100.47%，RSD=1.6% (n=5).Conclusion：The method is accurate，feasible and reproducible，can be effectively used for the quality standard of Shengxue Tiaoyuan Granule，and provide a scientific basis for the quality control and standard enhancing of Shengxue Tiaoyuan Granule.

Shengxue Tiaoyuan Granule；Quality standard；TLC；HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.08.013

2014-01-26)

*

黃掌欣，工程師，研究方向：新藥開發(fā)；E-mail：rghzx@126.com