大鼠心室肌細(xì)胞急性酶分離及瞬時(shí)外向鉀電流的記錄

張良勝等

[摘要] 目的 探索成年SD大鼠心室肌細(xì)胞急性酶分離及記錄瞬時(shí)外向鉀電流的方法。 方法 以成年SD大鼠為研究對(duì)象，利用Langendorff灌流系統(tǒng)，利用Ⅱ型膠原酶二步灌流方法分離細(xì)胞，利用膜片鉗技術(shù)記錄大鼠心室肌瞬時(shí)外向鉀電流。 結(jié)果 鏡下可見(jiàn)存活心?。撼蕳U狀或矩形，表面干凈，橫紋清晰，立體感強(qiáng)，能記錄出瞬時(shí)外向鉀電流達(dá)3000 pA。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)所用的方法細(xì)胞成活率高，能記錄出瞬時(shí)外向鉀電流。

[關(guān)鍵詞] 心肌細(xì)胞；瞬時(shí)外向鉀電流；膜片鉗技術(shù)

[中圖分類(lèi)號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）08（a）-0020-03

Separation of acute enzyme of ventricular myocyte and record of transient outward potassium current in rats

ZHANG Liang-sheng1 LI Ping1 XU Xiang1 WANG Li1 FAN Zhong-cai2

1.Department of Cardiology，People′s Hospital of Yongzhou City in Henan Privince，Yongzhou 476600，China；2.Department of Cardiology，Affliated Hospital of Luzhou Medical College， Luzhou 646000，China

[Abstract] Objective To explore the method of acute isolate of separation of acute enzyme of ventricular myocyte and recording transient outward potassium current in adult SD rats. Methods Adult SD rats were selected as subjects， Langendorff perfusion system and type Ⅱ collagenase two step perfusion method were used to separate cell， and pacth clamp technique was used to record transient outward potassium current of ventricular myocyte in rats. Results The viable myocardium was seen Microscopically：it is lod or a rectangle，the surface is clean with clear cross striations and strong three-dimensional senseand it can record the transient outward potassium current up to 3000 pA. Conclusion Survival rate of cell of the method applied in the experiment and transient outward potassium current can be recorded.

[Key words] Myocardial cell；Transient outward potassium current；Pacth clamp technique

成年大鼠心肌細(xì)胞的分離方法步驟比較復(fù)雜，條件要求很高，影響因素較多，不易獲得高質(zhì)量的心肌細(xì)胞，心肌細(xì)胞酶分離是難點(diǎn)，是膜片鉗實(shí)驗(yàn)記錄電流的基礎(chǔ)。40多年來(lái)，酶解法被用于成年大鼠的心肌分離，到目前為止，尚無(wú)統(tǒng)一方法可循[1-2]，本實(shí)驗(yàn)采用兩步酶解法分離出較好形態(tài)的心肌細(xì)胞，并且能記錄到瞬時(shí)外向鉀電流。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，清潔級(jí)，體重180～220 g，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，試驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物處置符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥品與試劑

氯化鈷（CoCl2），乙二醇雙四乙酸（EGTA），血清白蛋白（albumin），羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），?；撬幔╰aurine），膠原酶Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Worthington），谷氨酸（glutamic acid），天冬氨酸鉀（K-aspartate）均為Sigma公司產(chǎn)品，其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.3溶液配制

心肌細(xì)胞分離又一影響因素是溫度。放置心臟于4℃無(wú)鈣臺(tái)液中，能降低心肌氧耗量，保護(hù)心肌。25～30℃室溫下進(jìn)行心肌細(xì)胞分離，灌流液溫度37～38℃[10]。由于恒溫裝散熱，應(yīng)測(cè)量心臟懸掛端流出液溫度，據(jù)流出液溫度調(diào)整恒溫水浴的溫度。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞可在常溫下靜置保存，也可在37℃二氧化碳卵浮箱內(nèi)保存[11]。在本實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞存放在4℃冰箱內(nèi)，這樣細(xì)胞代謝降低，氧耗量降低，細(xì)胞保存時(shí)間會(huì)延長(zhǎng)。

以往國(guó)內(nèi)外常采用Langendorff四步酶解法來(lái)分離心肌細(xì)胞[2]?，F(xiàn)在大多采用兩步酶解法：①無(wú)鈣臺(tái)液灌流；②酶液灌流。本實(shí)驗(yàn)在龍毅[12-13]等報(bào)道的急性酶分離大鼠心房肌細(xì)胞方法的改進(jìn)基礎(chǔ)上操作，縮短心臟灌流的時(shí)間，減輕心肌缺血、缺氧時(shí)間，有利保存心肌細(xì)胞[14]。第一步灌流時(shí)間盡量在5 min內(nèi)，只要心臟流出液為清亮色，心臟停止跳動(dòng)即停止灌流。第二步酶液灌流：酶作用的強(qiáng)弱不同和種類(lèi)不同，灌流速度不同，灌流的時(shí)間也不同。本實(shí)驗(yàn)灌流速度為8 ml/min，消化時(shí)間為6～15 min。消化開(kāi)始時(shí)心臟呈紅褐色，質(zhì)軟，酶解過(guò)程中心臟體積增大，發(fā)白變硬，后期腫脹發(fā)白塌陷。換酶液6 min后，每隔1分鐘取1小塊左心室組織，共取10次，可獲得穩(wěn)定且質(zhì)量高的心肌細(xì)胞。

文獻(xiàn)報(bào)道處死大鼠方式有非麻醉法與麻醉法。多采用麻醉方法取心臟，麻醉可快速取心臟，縮短了懸掛心臟時(shí)間。若采用棒擊法或者斷頸法取心臟，操作者要非常熟練，熟練程度不夠會(huì)影響心肌細(xì)胞的獲得取。麻醉過(guò)深導(dǎo)致呼吸抑制，心肌細(xì)胞的獲得也會(huì)受影響。

鈣反常指無(wú)鈣溶液中分離的細(xì)胞當(dāng)再次進(jìn)入生理濃度鈣溶液中，細(xì)胞會(huì)不停地收縮，漸漸變圓，失去原來(lái)有序結(jié)構(gòu)和收縮功能直至溶解[15]。減少鈣反常的方法是改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，完善實(shí)驗(yàn)條件，提高心肌細(xì)胞質(zhì)量，要求熟練操作，適當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件控制。本方法分離的心肌細(xì)胞能耐鈣，成活率高。

注意整個(gè)操作過(guò)程中充氧，各種灌流液不能有氣泡，氣泡可堵塞冠狀動(dòng)脈，常規(guī)肝素化抗凝防血塊堵塞冠狀動(dòng)脈，所有的操作都要熟練。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Bkaily G，Sperelakis N，Doane J.A new method for preparation of isolated single adult myocytes[J].Am J Physiol，1984，247（6）：H1018-H1026.

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[8] 張丹，王鑫，王晞，等.心肌細(xì)胞的急性分離及瞬時(shí)外向鉀電流的記錄[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2010，23（8）：792-794.

[9] 朱肖星，牛小麟，朱蕭玲，等.不同活性的膠原酶對(duì)大鼠心肌細(xì)胞分離的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008，9（33）：1089-1091.

[10] 張華，劉惠亮，楊勝利，等.缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)人肥大心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)的變化[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2009，22（1）：12-15.

[11] 張軍，宋俊麗，武冬梅.膜片鉗實(shí)驗(yàn)中心肌細(xì)胞快速分離方法分析[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6（10）：1238-9.

[12] 龍毅，周亞南，殷躍輝.急性分離大鼠心房肌細(xì)胞方法的改進(jìn)及對(duì)鉀、鈉、 鈣電流的記錄[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，36（8）：910-912.

[13] 王騰，唐其栓，甘文云，等.大鼠心肌細(xì)胞的分離技術(shù)及電生理鑒定[J].科技導(dǎo)報(bào)，2009，27（3）：80-84.

[14] Wijffels MC，Kirchhof CJ，Dorland R，et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats[J].Circulation，1995，92（7）：1954-1968.

[15] Gallego M，Setien R，Puebla L.et al.Alpha1-Adrenoceptors stimulate a Galphas protein and reduce the ansient outward K+ current via a cAMP/PKA mediated pathway in the rat heart[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（3）：C577-C585.

（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：許俊琴）

文獻(xiàn)報(bào)道處死大鼠方式有非麻醉法與麻醉法。多采用麻醉方法取心臟，麻醉可快速取心臟，縮短了懸掛心臟時(shí)間。若采用棒擊法或者斷頸法取心臟，操作者要非常熟練，熟練程度不夠會(huì)影響心肌細(xì)胞的獲得取。麻醉過(guò)深導(dǎo)致呼吸抑制，心肌細(xì)胞的獲得也會(huì)受影響。

鈣反常指無(wú)鈣溶液中分離的細(xì)胞當(dāng)再次進(jìn)入生理濃度鈣溶液中，細(xì)胞會(huì)不停地收縮，漸漸變圓，失去原來(lái)有序結(jié)構(gòu)和收縮功能直至溶解[15]。減少鈣反常的方法是改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，完善實(shí)驗(yàn)條件，提高心肌細(xì)胞質(zhì)量，要求熟練操作，適當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件控制。本方法分離的心肌細(xì)胞能耐鈣，成活率高。

注意整個(gè)操作過(guò)程中充氧，各種灌流液不能有氣泡，氣泡可堵塞冠狀動(dòng)脈，常規(guī)肝素化抗凝防血塊堵塞冠狀動(dòng)脈，所有的操作都要熟練。

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[9] 朱肖星，牛小麟，朱蕭玲，等.不同活性的膠原酶對(duì)大鼠心肌細(xì)胞分離的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008，9（33）：1089-1091.

[10] 張華，劉惠亮，楊勝利，等.缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)人肥大心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)的變化[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2009，22（1）：12-15.

[11] 張軍，宋俊麗，武冬梅.膜片鉗實(shí)驗(yàn)中心肌細(xì)胞快速分離方法分析[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6（10）：1238-9.

[12] 龍毅，周亞南，殷躍輝.急性分離大鼠心房肌細(xì)胞方法的改進(jìn)及對(duì)鉀、鈉、 鈣電流的記錄[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，36（8）：910-912.

[13] 王騰，唐其栓，甘文云，等.大鼠心肌細(xì)胞的分離技術(shù)及電生理鑒定[J].科技導(dǎo)報(bào)，2009，27（3）：80-84.

[14] Wijffels MC，Kirchhof CJ，Dorland R，et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats[J].Circulation，1995，92（7）：1954-1968.

[15] Gallego M，Setien R，Puebla L.et al.Alpha1-Adrenoceptors stimulate a Galphas protein and reduce the ansient outward K+ current via a cAMP/PKA mediated pathway in the rat heart[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（3）：C577-C585.

（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：許俊琴）

文獻(xiàn)報(bào)道處死大鼠方式有非麻醉法與麻醉法。多采用麻醉方法取心臟，麻醉可快速取心臟，縮短了懸掛心臟時(shí)間。若采用棒擊法或者斷頸法取心臟，操作者要非常熟練，熟練程度不夠會(huì)影響心肌細(xì)胞的獲得取。麻醉過(guò)深導(dǎo)致呼吸抑制，心肌細(xì)胞的獲得也會(huì)受影響。

鈣反常指無(wú)鈣溶液中分離的細(xì)胞當(dāng)再次進(jìn)入生理濃度鈣溶液中，細(xì)胞會(huì)不停地收縮，漸漸變圓，失去原來(lái)有序結(jié)構(gòu)和收縮功能直至溶解[15]。減少鈣反常的方法是改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，完善實(shí)驗(yàn)條件，提高心肌細(xì)胞質(zhì)量，要求熟練操作，適當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件控制。本方法分離的心肌細(xì)胞能耐鈣，成活率高。

注意整個(gè)操作過(guò)程中充氧，各種灌流液不能有氣泡，氣泡可堵塞冠狀動(dòng)脈，常規(guī)肝素化抗凝防血塊堵塞冠狀動(dòng)脈，所有的操作都要熟練。

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[8] 張丹，王鑫，王晞，等.心肌細(xì)胞的急性分離及瞬時(shí)外向鉀電流的記錄[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2010，23（8）：792-794.

[9] 朱肖星，牛小麟，朱蕭玲，等.不同活性的膠原酶對(duì)大鼠心肌細(xì)胞分離的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2008，9（33）：1089-1091.

[10] 張華，劉惠亮，楊勝利，等.缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)人肥大心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)的變化[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2009，22（1）：12-15.

[11] 張軍，宋俊麗，武冬梅.膜片鉗實(shí)驗(yàn)中心肌細(xì)胞快速分離方法分析[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6（10）：1238-9.

[12] 龍毅，周亞南，殷躍輝.急性分離大鼠心房肌細(xì)胞方法的改進(jìn)及對(duì)鉀、鈉、 鈣電流的記錄[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，36（8）：910-912.

[13] 王騰，唐其栓，甘文云，等.大鼠心肌細(xì)胞的分離技術(shù)及電生理鑒定[J].科技導(dǎo)報(bào)，2009，27（3）：80-84.

[14] Wijffels MC，Kirchhof CJ，Dorland R，et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation.A study in awake chronically instrumented goats[J].Circulation，1995，92（7）：1954-1968.

[15] Gallego M，Setien R，Puebla L.et al.Alpha1-Adrenoceptors stimulate a Galphas protein and reduce the ansient outward K+ current via a cAMP/PKA mediated pathway in the rat heart[J].Am J Physiol Cell Physiol，2005，288（3）：C577-C585.

（收稿日期：2014-05-21 本文編輯：許俊琴）