光溫條件對煙葉唇柱苣苔葉片離體培養(yǎng)的影響

黃賽+潘梅+戚華莎+王景飛+呂德任

基金項目 2013年海南省科學事業(yè)費項目“海南苦苣苔科植物2個特有種的引種栽培和快繁技術研究”（瓊財預〔2013〕131號）。

摘要以煙葉唇柱苣苔葉片為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，研究了光照強度和溫度對煙葉唇柱苣苔葉片離體培養(yǎng)的影響，以期篩選出各培養(yǎng)階段最佳光照強度和溫度。結果表明，葉片不定芽誘導的最佳光照強度是1 000 lx，最佳溫度為28 ℃，40 d不定芽誘導率95.83%；不定芽增殖和生根的最佳光照強度是1 500 lx，最佳溫度為28 ℃，40 d不定芽增殖倍數達7.24倍，生根率100.00%，平均生根數多達21.33條。

關鍵詞煙葉唇柱苣苔；溫光條件；葉片；不定芽；組織培養(yǎng)

中圖分類號Q949.778.4；Q943.1文獻標識碼A文章編號 1007-5739（2014）11-0155-02

煙葉唇柱苣苔（Chirita heterotricha Merr.）是苦苣苔科唇柱苣苔屬多年生草本，生于海拔約430 m的山谷林中或溪邊石上[1]，是海南省特有的野生花卉，具有極大的開發(fā)潛力。湯正輝對煙葉唇柱苣苔葉片不定芽的分化及生根進行了研究[2]，但有關光照及溫度等環(huán)境條件在其離體培養(yǎng)中的影響未見有報道。本試驗以煙葉唇柱苣苔無菌葉片作為試驗材料，研究了不同光照強度和溫度對葉片不定芽的分化、增殖以及生根的影響，以期篩選出各培養(yǎng)階段最為合適的光照強度和溫度。

1材料與方法

1.1試驗材料

植株采自海南省保亭縣，取幼葉作為外植體材料。供試植物生長調節(jié)劑為6-BA（6-芐基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）?；九囵B(yǎng)基為MS。

1.2試驗設計

以MS為基本培養(yǎng)基，根據試驗目的添加植物生長調節(jié)劑6-BA和NAA，附加白糖30 g/L、卡拉膠9 g/L，滅菌前pH值為5.8，配制分裝后，于溫度121 ℃、壓力0.14 MPa高溫高壓下滅菌20 min。材料接種后移入培養(yǎng)室，光照強度設置1 000、1 500、2 000 lx等3個處理，溫度設置25、28、31 ℃ 3個處理，光照時間8 h/d，每個處理接種8袋，每袋3個材料，3次重復，定期觀察記錄，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計結果。

1.3試驗方法

1.3.1無菌材料的建立。將煙葉唇柱苣苔的幼嫩葉片在自來水中洗去污物，用棉花蘸洗潔精液擦拭葉片兩面，沖洗干凈后移入超凈工作臺，先用75%酒精浸泡10 s，再用0.2‰ HgCl2溶液浸泡3 min，無菌水沖洗3次，最后用2%次氯酸鈉溶液浸泡15 min，無菌水沖洗5次。將葉片切成1 cm×1 cm見方的小塊，以葉背朝下接種于MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上。接種15 d后，葉面開始膨大隆起，25 d開始有小芽點萌動，40 d在葉片邊緣、主葉脈基部和葉面處均分化出不定芽。取不定芽葉片作為研究試驗材料。

1.3.2不定芽的誘導。

（1）光照強度對葉片不定芽誘導的影響。取無菌植株小葉片（約0.5 cm×0.5 cm）以葉背接入MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基[2]，置于溫度28 ℃、不同光照強度的培養(yǎng)室中，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計葉片不定芽誘導率和平均不定芽數。

（2）溫度對葉片不定芽誘導的影響。取無菌植株小葉片（約0.5 cm×0.5 cm）以葉背接入MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上，置于光照強度1 500 lx、不同溫度的培養(yǎng)室中，40 d后統(tǒng)計葉片不定芽誘導率和平均不定芽數。

1.3.3不定芽的增殖。

（1）光照強度對不定芽增殖的影響。將單個不定芽接入MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中，置于溫度28 ℃、不同光照強度的培養(yǎng)室中，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計不定芽增殖倍數。

（2）溫度對葉片不定芽增殖的影響。將單個不定芽接入MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中，置于光照強度1 500 lx、不同溫度的培養(yǎng)室中，40 d后統(tǒng)計不定芽增殖倍數。

1.3.4生根培養(yǎng)。

（1）光照強度對不定芽生根的影響。將高度達到1.2 cm的不定芽接入MS+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，置于溫度28 ℃、不同光照強度的培養(yǎng)室中，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計不定芽生根率、生根數、株高。

（2）溫度對不定芽生根的影響。將高度達到1.2 cm的不定芽接入MS+NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中，置于光照強度1 500 lx、不同溫度的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，30 d后統(tǒng)計不定芽生根率、生根數、株高和最長根。

1.4統(tǒng)計方法

計算公式為：不定芽誘導率（%）=誘導出芽葉片數/接種葉片數×100，平均不定芽數=不定芽總數/誘導出芽葉片數，不定芽增殖倍數=培養(yǎng)40 d不定芽總數/接種不定芽數，生根率（%）=生根植株數/接種植株數×100，生根數=植株生根總數/生根植株數。試驗結果均進行方差分析，F(xiàn)測驗顯著后用新復極差法（SSR）進行多重比較，統(tǒng)計結果均為99%水平。

2結果與分析

2.1不定芽的誘導

（1）不同光照強度對煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導的影響。由表1可知，光照強度1 000 lx時，煙葉唇柱苣苔不定芽誘導率和平均不定芽數最高，分別為95.83%和7.10個/葉，芽的生長勢最好；光照強度為1 500 lx時，不定芽誘導率較低，為83.33%，平均不定芽數為5.50個/葉，芽生長勢較差；光照強度2 000 lx時，不定芽誘導率最低為68.18%，平均不定芽數也最小為3.36個/葉，芽的生長勢最差，可見光照強度高于1 000 lx時不利于芽的分化和生長，光照強度越高，誘導效果越差。方差分析結果表明，3種光照強度之間不定芽誘導率和平均不定芽數的差異達到極顯著水平，因此煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導的最適宜光照強度為1 000 lx。

（2）不同溫度對煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導的影響。由表2可知，培養(yǎng)溫度28 ℃的不定芽誘導效果最好，不定芽誘導率最高，達到94.74%，平均每葉分化不定芽數最多，為7.34個，極顯著高于其他處理；25 ℃的不定芽誘導率和平均不定芽數次之，與31 ℃的不定芽誘導率差異極顯著，而平均不定芽數差異極不顯著。從生長勢看，28 ℃的不定芽生長勢最好，25 ℃的次之，31 ℃的最差。因此，煙葉唇柱苣苔葉片不定芽誘導最佳溫度為28 ℃。

2.2不定芽增殖

（1）不同光照強度對煙葉唇柱苣苔不定芽增殖的影響。由表3可知，不同光照強度對煙葉唇柱苣苔不定芽增殖的影響極大，各處理間的差異達到極顯著水平，其中1 500 lx的光照強度對不定芽的誘導生長效果最好，40 d不定芽增殖倍數達到7.24倍，極顯著高于其他各處理，而且不定芽長勢好，芽苗健壯，葉色深綠。1 000 lx的不定芽增殖倍數為6.66倍，極顯著高于2 000 lx的增殖倍數，由此可見，煙葉唇柱苣苔不定芽的增殖不需要太強的光照，1 500 lx的光照強度最適宜不定芽的增殖與生長。

（2）不同溫度對煙葉唇柱苣苔不定芽增殖的影響。由表4可知，在28 ℃溫度下培養(yǎng)40 d，煙葉唇柱苣苔不定芽的增殖倍數最高，達到7.09倍，其次是25 ℃，增殖倍數為6.28倍，最低的是31 ℃，只有3.93倍。方差分析結果表明，25 ℃和28 ℃的增殖倍數差異極不顯著，而二者與31 ℃的差異極為顯著。從生長勢看，25 ℃和28 ℃溫度培養(yǎng)下，不定芽長勢好，芽體健壯，31 ℃培養(yǎng)溫度芽苗長勢差、芽細、有較多的枯葉。因此，煙葉唇柱苣苔不定芽增殖與生長的適宜的溫度為25~28 ℃，最佳溫度為28 ℃。

2.3不定芽生根

（1）不同光照強度對煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表5可知，3種光照強度對煙葉唇柱苣苔生根數、株高和生長勢的影響不明顯，三者之間的差異極不顯著；而對生根率則有一定的影響，1 000 lx和1 500 lx的生根率達到100.00%，二者與2 000 lx的生根率97.78%差異極顯著。因此，煙葉唇柱苣苔葉片不定芽生根的適宜光照強度為1 000~1 500 lx，最佳光照強度為1 500 lx。

（2）不同溫度對煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表6可知，28 ℃的誘根效果最好，煙葉唇柱苣苔生根率、生根數和株高分別為100.00%、18.92條、2.18 cm，與25 ℃的生根率和株高差異極不顯著，生根數的差異則達到極顯著水平；28 ℃與31 ℃的生根率、生根數和株高的差異，則達到極顯著水平。從生長狀況看，在25~28 ℃的溫度下培養(yǎng)，植株健壯，葉色濃綠；31 ℃的培養(yǎng)溫度下，植株生長勢差，細弱矮小，葉色枯黃。綜合試驗結果，煙葉唇柱苣苔不定芽生根的最佳溫度為28 ℃。

3結論與討論

在植物的離體培養(yǎng)過程中，適宜的光照強度和溫度是培養(yǎng)中的細胞所必需的，其對培養(yǎng)物的生長發(fā)育影響很大。不同植物試管芽苗對光照強度有不同的反應[3-4]。試驗結果表明，1 000~1 500 lx的光照強度即可以滿足煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)需求，而各階段最適宜的光照強度有所不同，其中葉片不定芽誘導的最佳光照強度為1 000 lx，不定芽增殖培養(yǎng)最佳光照強度為1 500 lx，1 000~1 500 lx的光照強度適宜不定芽的生根培養(yǎng)，二者的誘根效果差異極不顯著。本試驗中，煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)其不定芽的誘導、增殖和生根最佳溫度均為28 ℃，在該溫度下，不定芽誘導率、芽的增殖倍數、生根率、平均生根條數及植株高度均為最高值，而且培養(yǎng)物的生長勢最好[5-6]。

4參考文獻

[1] 李桭宇，王印波.中國苣苔科植物[M].北京：河南科學技術出版社，2005：4-5.

[2] 湯正輝.苦苣苔科植物的快速繁殖、離體保存及耐陰性研究[D].成都：四川大學，2007.

[3] 王玉英，高新一.植物組織培養(yǎng)技術手冊[M].北京：金盾出版社，2006（37）：89-90.

[4] 溫放.廣西苦苣苔科觀賞植物資源調查與引種研究[D].北京：北京林業(yè)大學，2008.

[5] 鄭曉珂，李軍，馮衛(wèi)生，等.苦苣苔科植物研究進展[J].中國新藥雜志，2003（4）：261-263.

[6] 呂惠珍，余麗瑩，黃寶優(yōu)，等.廣西苦苣苔科藥用植物資源[J].中國民族民間醫(yī)藥，2010（7）：6-10.

2.3不定芽生根

（1）不同光照強度對煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表5可知，3種光照強度對煙葉唇柱苣苔生根數、株高和生長勢的影響不明顯，三者之間的差異極不顯著；而對生根率則有一定的影響，1 000 lx和1 500 lx的生根率達到100.00%，二者與2 000 lx的生根率97.78%差異極顯著。因此，煙葉唇柱苣苔葉片不定芽生根的適宜光照強度為1 000~1 500 lx，最佳光照強度為1 500 lx。

（2）不同溫度對煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表6可知，28 ℃的誘根效果最好，煙葉唇柱苣苔生根率、生根數和株高分別為100.00%、18.92條、2.18 cm，與25 ℃的生根率和株高差異極不顯著，生根數的差異則達到極顯著水平；28 ℃與31 ℃的生根率、生根數和株高的差異，則達到極顯著水平。從生長狀況看，在25~28 ℃的溫度下培養(yǎng)，植株健壯，葉色濃綠；31 ℃的培養(yǎng)溫度下，植株生長勢差，細弱矮小，葉色枯黃。綜合試驗結果，煙葉唇柱苣苔不定芽生根的最佳溫度為28 ℃。

3結論與討論

在植物的離體培養(yǎng)過程中，適宜的光照強度和溫度是培養(yǎng)中的細胞所必需的，其對培養(yǎng)物的生長發(fā)育影響很大。不同植物試管芽苗對光照強度有不同的反應[3-4]。試驗結果表明，1 000~1 500 lx的光照強度即可以滿足煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)需求，而各階段最適宜的光照強度有所不同，其中葉片不定芽誘導的最佳光照強度為1 000 lx，不定芽增殖培養(yǎng)最佳光照強度為1 500 lx，1 000~1 500 lx的光照強度適宜不定芽的生根培養(yǎng)，二者的誘根效果差異極不顯著。本試驗中，煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)其不定芽的誘導、增殖和生根最佳溫度均為28 ℃，在該溫度下，不定芽誘導率、芽的增殖倍數、生根率、平均生根條數及植株高度均為最高值，而且培養(yǎng)物的生長勢最好[5-6]。

4參考文獻

[1] 李桭宇，王印波.中國苣苔科植物[M].北京：河南科學技術出版社，2005：4-5.

[2] 湯正輝.苦苣苔科植物的快速繁殖、離體保存及耐陰性研究[D].成都：四川大學，2007.

[3] 王玉英，高新一.植物組織培養(yǎng)技術手冊[M].北京：金盾出版社，2006（37）：89-90.

[4] 溫放.廣西苦苣苔科觀賞植物資源調查與引種研究[D].北京：北京林業(yè)大學，2008.

[5] 鄭曉珂，李軍，馮衛(wèi)生，等.苦苣苔科植物研究進展[J].中國新藥雜志，2003（4）：261-263.

[6] 呂惠珍，余麗瑩，黃寶優(yōu)，等.廣西苦苣苔科藥用植物資源[J].中國民族民間醫(yī)藥，2010（7）：6-10.

2.3不定芽生根

（1）不同光照強度對煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表5可知，3種光照強度對煙葉唇柱苣苔生根數、株高和生長勢的影響不明顯，三者之間的差異極不顯著；而對生根率則有一定的影響，1 000 lx和1 500 lx的生根率達到100.00%，二者與2 000 lx的生根率97.78%差異極顯著。因此，煙葉唇柱苣苔葉片不定芽生根的適宜光照強度為1 000~1 500 lx，最佳光照強度為1 500 lx。

（2）不同溫度對煙葉唇柱苣苔不定芽生根的影響。由表6可知，28 ℃的誘根效果最好，煙葉唇柱苣苔生根率、生根數和株高分別為100.00%、18.92條、2.18 cm，與25 ℃的生根率和株高差異極不顯著，生根數的差異則達到極顯著水平；28 ℃與31 ℃的生根率、生根數和株高的差異，則達到極顯著水平。從生長狀況看，在25~28 ℃的溫度下培養(yǎng)，植株健壯，葉色濃綠；31 ℃的培養(yǎng)溫度下，植株生長勢差，細弱矮小，葉色枯黃。綜合試驗結果，煙葉唇柱苣苔不定芽生根的最佳溫度為28 ℃。

3結論與討論

在植物的離體培養(yǎng)過程中，適宜的光照強度和溫度是培養(yǎng)中的細胞所必需的，其對培養(yǎng)物的生長發(fā)育影響很大。不同植物試管芽苗對光照強度有不同的反應[3-4]。試驗結果表明，1 000~1 500 lx的光照強度即可以滿足煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)需求，而各階段最適宜的光照強度有所不同，其中葉片不定芽誘導的最佳光照強度為1 000 lx，不定芽增殖培養(yǎng)最佳光照強度為1 500 lx，1 000~1 500 lx的光照強度適宜不定芽的生根培養(yǎng)，二者的誘根效果差異極不顯著。本試驗中，煙葉唇柱苣苔葉片的離體培養(yǎng)其不定芽的誘導、增殖和生根最佳溫度均為28 ℃，在該溫度下，不定芽誘導率、芽的增殖倍數、生根率、平均生根條數及植株高度均為最高值，而且培養(yǎng)物的生長勢最好[5-6]。

4參考文獻

[1] 李桭宇，王印波.中國苣苔科植物[M].北京：河南科學技術出版社，2005：4-5.

[2] 湯正輝.苦苣苔科植物的快速繁殖、離體保存及耐陰性研究[D].成都：四川大學，2007.

[3] 王玉英，高新一.植物組織培養(yǎng)技術手冊[M].北京：金盾出版社，2006（37）：89-90.

[4] 溫放.廣西苦苣苔科觀賞植物資源調查與引種研究[D].北京：北京林業(yè)大學，2008.

[5] 鄭曉珂，李軍，馮衛(wèi)生，等.苦苣苔科植物研究進展[J].中國新藥雜志，2003（4）：261-263.

[6] 呂惠珍，余麗瑩，黃寶優(yōu)，等.廣西苦苣苔科藥用植物資源[J].中國民族民間醫(yī)藥，2010（7）：6-10.