纖毛蟲偽紅色雙軸蟲營養(yǎng)細(xì)胞和休眠包囊的超微結(jié)構(gòu)觀察

孫 磊，運(yùn)迷霞，顧?？担饿矽i

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200062)

原生動(dòng)物纖毛蟲在不利生長條件下經(jīng)常會(huì)形成包囊，而一旦環(huán)境條件變?yōu)橛欣麜r(shí)其形成包囊的細(xì)胞又會(huì)脫囊而出，進(jìn)行正常的生命活動(dòng).纖毛蟲形成包囊和脫包囊期間，細(xì)胞結(jié)構(gòu)也相伴發(fā)生去分化和再分化的過程，這可能是纖毛蟲細(xì)胞在特殊生理?xiàng)l件下進(jìn)行結(jié)構(gòu)重組的一種生存策略［1］.研究纖毛蟲的包囊現(xiàn)象，對于揭示細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成和調(diào)控具有重要學(xué)術(shù)意義［2-3］.目前，對纖毛蟲形成包囊和脫包囊過程中纖毛結(jié)構(gòu)的分化已有較為深入的了解，根據(jù)纖毛蟲形成包囊后纖毛結(jié)構(gòu)的分化特征，提出了纖毛蟲形成毛基體吸收型包囊、毛基體非吸收型包囊和尾柱蟲類包囊三種類型包囊［4-5］，但對不同類群的纖毛蟲形成包囊后細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)分化及其生命活動(dòng)特征尚知之不多.作者通過對腹毛類纖毛蟲偽紅色雙軸蟲(Diaxonella pseudorubra)營養(yǎng)期細(xì)胞和包囊細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察，探索了不同生理?xiàng)l件下細(xì)胞核器、線粒體、黏液泡等結(jié)構(gòu)的分化，獲得了若干新的結(jié)果，報(bào)道如下.

1 材料與方法

1.1 材料

偽紅色雙軸蟲采自山東省濟(jì)南市趵突泉.在室溫下，應(yīng)用池塘過濾水加麥粒制備細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)液，接種纖毛蟲進(jìn)行純系培養(yǎng).將纖毛蟲培養(yǎng)至較高密度后，不更換培養(yǎng)液，致使培養(yǎng)液“老化”，誘導(dǎo)纖毛蟲形成包囊.以非分裂狀態(tài)的營養(yǎng)期纖毛蟲和包囊時(shí)期的纖毛蟲為材料制備掃描電鏡(Scanning Electron Microscopy，SEM)和透射電鏡(Transmission Electron Microscopy，TEM)樣品.

1.2 掃描電鏡樣品制備和觀察

掃描電鏡制樣方法參考顧福康［6］等的方法作少許調(diào)整，收集生長狀態(tài)較好的營養(yǎng)期細(xì)胞和不同時(shí)期的包囊細(xì)胞，用池塘過濾水清洗3～4次后固定，固定液由1%的鋨酸和飽和升汞溶液按1∶6(體積比)混合而成.固定5 min后，用0.1 mol/L PBS清洗3次，5 min/次.此后以梯度乙醇脫水，轉(zhuǎn)入醋酸異戊酯，經(jīng)臨界點(diǎn)干燥，裝臺(tái)噴金制得樣品，在JSM-5610掃描電子顯微鏡下觀察、照相.

1.3 透射電鏡樣品制備和觀察

透射電鏡制樣方法參考顧?？担?］的方法作少許調(diào)整，收集生長狀態(tài)良好的纖毛蟲營養(yǎng)期細(xì)胞和形成包囊的細(xì)胞，用池塘過濾水清洗3～4次后固定.其中前固定液由5%的戊二醛和2%的鋨酸等體積混合而成，于4℃下固定10 min，0.1 mol/L PBS清洗3次，5 min/次，然后用1%鋨酸后固定1 h，梯度丙酮脫水，Epon812樹脂包埋，LKB超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，JEM2100透射電鏡觀察和照相.

2 結(jié)果

2.1 營養(yǎng)期纖毛蟲的超微結(jié)構(gòu)

2.1.1 掃描電鏡術(shù)顯示的表面結(jié)構(gòu)

偽紅色雙軸蟲細(xì)胞長約145μm、寬約35μm，胞體呈長棒狀，前部鈍圓，尾部略尖.皮層腹面纖毛器中，口圍帶約由34片小膜組成，波動(dòng)膜2片;額區(qū)棘毛包括額棘毛和口棘毛兩部分，其中額棘毛3根，擬口棘毛約4根，口棘毛5根;中腹棘毛列約由15對棘毛組成，延伸至蟲體3/5處;橫棘毛約8根;左緣棘毛2或3列，自右至左每列的棘毛數(shù)依次減少，右緣棘毛一列，縱貫細(xì)胞全長(圖1:1).背皮層纖毛器中，背觸毛3或4列(圖1:2).

2.1.2 透射電鏡觀察

偽紅色雙軸蟲細(xì)胞外圍是由質(zhì)膜和表膜泡組成的表膜結(jié)構(gòu)，表膜下微管按規(guī)則排列形成由單層微管加固的表質(zhì)層(圖2:1).在經(jīng)過口圍帶的切片中，各片小膜按一定間隔排列，各含3列纖毛或纖毛基體(圖2:2).

大核由兩層核膜包圍，在核膜位置偶見核孔，此外也有不少膜樣結(jié)構(gòu)或膜泡與核膜外膜相聯(lián)系;大核染色質(zhì)聚集成大小不一的團(tuán)塊狀，非均一地分布在核內(nèi)，也有些染色質(zhì)附著在核膜內(nèi)膜;核仁較小，著色較深，分布在核內(nèi)一側(cè)(圖2:3).小核由兩層核膜包圍，核內(nèi)染色質(zhì)成致密均一分布，染色質(zhì)顆粒大小相似，但很少附著于核膜上(圖2:4).

在表膜下細(xì)胞質(zhì)至細(xì)胞深部含有線粒體、食物泡、黏液泡和色素顆粒等細(xì)胞器.其中，線粒體由雙層膜包圍，內(nèi)膜折疊形成管狀嵴(圖2:5)，在皮層纖毛器、細(xì)胞核及食物泡附近大量分布(圖2:2，3，6，7);食物泡呈不規(guī)則的球形，其外圍單層膜，泡內(nèi)充滿處于消化中的膜泡樣和顆粒狀的物質(zhì)(圖2:8);黏液泡在營養(yǎng)期細(xì)胞中大量存在(圖2:9)，其由單層膜包圍，內(nèi)含顆粒狀晶體(圖2:10);色素顆粒主要包括直徑約0.2μm和直徑約0.5μm的兩種不同大小，也偶見直徑大于0.5μm的顆粒(圖2:12).此外，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見到少數(shù)電子密度較高的直徑和長度約為0.25μm和0.5μm的梭形體，其被包圍在粘滯狀的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可能是一類共生性的細(xì)菌(圖2:11).

2.2 包囊期纖毛蟲的超微結(jié)構(gòu)

2.2.1 纖毛蟲形成包囊的形態(tài)學(xué)

偽紅色雙軸蟲形成包囊時(shí)，細(xì)胞逐漸收縮，胞體經(jīng)歷了從長棒形至橢圓形、直至球形的變化，腹面纖毛器中口圍帶和波動(dòng)膜、額腹橫腹棘毛和左右緣棘毛匯聚在一起，并伴隨著退化、瓦解和消失的過程，期間背面背觸毛則在無明顯移位的情況下發(fā)生退化和瓦解，最終細(xì)胞被其分泌形成的包囊壁包圍起來，成為圓球形的休眠包囊(圖3).

2.2.2 休眠包囊的超微結(jié)構(gòu)

圖1 偽紅色雙軸蟲細(xì)胞的掃描電鏡觀察(標(biāo)尺:10μm)Fig.1 SEM image of vegetative cells of D.pseudorubra(Scale bars:10μm)

圖2 偽紅色雙軸蟲細(xì)胞的透射電鏡觀察(標(biāo)尺:0.5μm)Fig.2 TEM image of vegetative cells of Diaxonella pseudorubra(Scale bars:0.5 μm)

圖3 偽紅色雙軸蟲包囊形成時(shí)期的掃描電鏡觀察(標(biāo)尺:10μm)Fig.3 SEM image of Diaxonella pseudorubra in encystation period(Scale bars:10 μm)

偽紅色雙軸蟲休眠包囊細(xì)胞外圍的包囊壁包括外壁層，中壁層和顆粒層三層壁結(jié)構(gòu).其中外層壁厚，壁內(nèi)含物電子密度低;中壁層電子密度高，壁較薄;內(nèi)層壁薄，電子密度介于前兩者之間(圖4:1).休眠細(xì)胞的表膜緊貼包囊壁內(nèi)壁，表膜下部分區(qū)段尚存在微管層，但也見部分微管層微管結(jié)構(gòu)已顯模糊，或處于退化狀態(tài);皮層纖毛器中大部分結(jié)構(gòu)被吸收，但也有少數(shù)纖毛結(jié)構(gòu)其纖毛桿被吸收而基體則殘留在表膜下細(xì)胞質(zhì)中(圖4:2).休眠細(xì)胞的大核進(jìn)一步凝縮，核外除偶見泡狀物附著在核膜上外，少見與之相聯(lián)系的細(xì)胞質(zhì)膜性結(jié)構(gòu);核內(nèi)除核仁外，大部分染色質(zhì)附著在核內(nèi)膜，僅少部分處于核質(zhì)中(圖4:3);小核核膜清晰可見，核內(nèi)染色質(zhì)成均一分布，染色質(zhì)大小相近(圖4:4).

圖4 偽紅色雙軸蟲休眠包囊的透射電鏡觀察(標(biāo)尺:0.5μm)Fig.4 TEM image of Diaxonella pseudorubra in cysts period(Scale bars:0.5 μm)

其中，線粒體大多分布于細(xì)胞表膜下，呈橢圓形和梭形，其內(nèi)外兩層膜及其嵴結(jié)構(gòu)清晰可見(圖4:5);黏液泡數(shù)量仍較多，形態(tài)結(jié)構(gòu)與營養(yǎng)時(shí)期非常相似(圖4:6);色素顆粒主要以兩種形態(tài)存在，一種顆粒直徑約為0.2μm，另一種顆粒直徑約為0.5μm，直徑大于0.5μm的顆粒很少見(圖4:7);共生細(xì)菌外圍一層低電子密度的保護(hù)層，其菌體呈較高電子密度(圖4:8-9)，也偶見剛完成分裂并已經(jīng)分離的前后兩個(gè)共生菌(圖4:10);自噬泡近似圓形，但大小不一(圖4:11-12)，泡中含有正在被消化的線粒體、色素顆粒(圖4:11)和共生菌(圖4:12)，也見部分泡外的線粒體膜與自噬泡膜發(fā)生聯(lián)系，然后整個(gè)線粒體被包裹在自噬泡內(nèi)，其膜和嵴都逐漸消融，經(jīng)歷被自噬泡消化的過程(圖4:11).

3 討論

3.1 偽紅色雙軸蟲形成包囊的類型及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

前人在對腹毛類纖毛蟲形成包囊的研究中觀察到，尖毛蟲類纖毛蟲形成包囊后，其細(xì)胞的纖毛結(jié)構(gòu)和表膜下微管全部吸收，形成“毛基體吸收型”包囊［4］;游仆蟲類纖毛蟲形成包囊后，其細(xì)胞的大部分纖毛和微管結(jié)構(gòu)被吸收，但部分纖毛基體則被保留下來，形成“毛基體非吸收型包囊”;尾柱蟲類纖毛蟲形成包囊后，其細(xì)胞的大部分纖毛結(jié)構(gòu)被吸收，但保留了少部分的毛基體和微管，形成又一類特殊的“尾柱蟲類包囊”［4-5］.

本研究工作發(fā)現(xiàn)，偽紅色雙軸蟲形成包囊的過程中，細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生明顯的自噬作用，細(xì)胞分泌物質(zhì)形成由內(nèi)壁層、中壁層和外壁層包裹的三層壁結(jié)構(gòu)，細(xì)胞皮層纖毛器中纖毛桿全部被吸收，但一部分基體和表膜下的微管保留下來.根據(jù)纖毛蟲休眠包囊中皮層纖毛器和微管結(jié)構(gòu)的分化特征，該纖毛蟲形成的包囊為“尾柱蟲類包囊”.

3.2 偽紅色雙軸蟲自噬泡消化現(xiàn)象

休眠細(xì)胞中自噬泡的最重要的作用就是將細(xì)胞失去功能和結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器和細(xì)胞顆粒進(jìn)行消化，為細(xì)胞的休眠生理活動(dòng)提供物質(zhì)和能量［7］.以往的研究中曾報(bào)道過在包囊游仆蟲(Euplotes encysticus)、魏氏擬尾柱蟲(Paraurostyla weissei)和冠突偽尾柱蟲(Pseudourostyla cristata)的休眠包囊中觀察到細(xì)胞內(nèi)自噬泡消化現(xiàn)象，但尚未觀察到自噬泡消化細(xì)胞內(nèi)胞器的具體過程［8-11］.本文進(jìn)一步觀察到，偽紅色雙軸蟲休眠細(xì)胞中也存在自噬泡消化現(xiàn)象，其中，自噬泡不僅將失去功能的線粒體等膜性細(xì)胞器進(jìn)行消化，也將細(xì)胞內(nèi)色素顆粒、黏液泡及共生菌等包裹在內(nèi)進(jìn)行消化，其中值得注意的是，部分失去功能的線粒體在退化過程中能與附近的大自噬泡融合在一起，經(jīng)歷消化過程，這種現(xiàn)象未見報(bào)道.所得結(jié)果表明，纖毛蟲休眠細(xì)胞中，自噬泡消化是細(xì)胞生命活動(dòng)中渡過不良環(huán)境條件的基本過程，自噬泡消化的對象不僅涉及細(xì)胞內(nèi)胞器，還可能涉及細(xì)胞內(nèi)共生體.

3.3 偽紅色雙軸蟲休眠細(xì)胞中其他胞質(zhì)細(xì)胞器和細(xì)胞質(zhì)顆粒的可能作用

與營養(yǎng)期細(xì)胞比較，如同其他纖毛蟲例如包囊游仆蟲那樣［12］，偽紅色雙軸蟲休眠細(xì)胞中小核沒有變化，但大核則發(fā)生了明顯的變化，其兩者不同的特征與各自的功能有關(guān)，也表明大核在細(xì)胞不同生理狀態(tài)下的功能活動(dòng)與結(jié)構(gòu)分化的特征;在營養(yǎng)期纖毛蟲中線粒體的數(shù)量非常多，尤其在纖毛器和其他各種細(xì)胞器的功能活動(dòng)位置線粒體進(jìn)一步聚集，表明線粒體在細(xì)胞生命活動(dòng)及其能量利用中的作用，但在纖毛蟲休眠細(xì)胞中線粒體數(shù)量減少，這與細(xì)胞在休眠生命活動(dòng)中的代謝及能量需求降低是相一致的，也與細(xì)胞調(diào)控有關(guān);休眠細(xì)胞中的黏液泡、色素顆粒及共生菌呈現(xiàn)與營養(yǎng)細(xì)胞中的同種結(jié)構(gòu)相似的形態(tài)，盡管三者在纖毛蟲營養(yǎng)細(xì)胞中行使不同的功能并具有各自的傳遞機(jī)制［13-16］，但在形成包囊過程中均沒有發(fā)生明顯的變化，可能是由營養(yǎng)細(xì)胞分化為包囊的過程中未發(fā)生變化而保留下來的，這也說明所述細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)在細(xì)胞不同生理?xiàng)l件下相對穩(wěn)定存在的可能原因.但值得注意的是，除細(xì)胞核外，在纖毛蟲休眠細(xì)胞中均觀察到線粒體、黏液泡、色素顆粒及共生菌被自噬泡消化的現(xiàn)象，表明這些細(xì)胞器或結(jié)構(gòu)在細(xì)胞休眠生命活動(dòng)中可能是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)利用和能量的主要來源.

［1］顧福康，張作人.纖毛蟲形成包囊和脫包囊的研究及其意義［J］.動(dòng)物學(xué)雜志，1992，27(5):48-53.

［2］吳月華，季玲妹，顧?？?原生動(dòng)物細(xì)胞休眠現(xiàn)象的研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物學(xué)雜志，2004，39(5):91-95.

［3］Verni F，Rosati G.Resting cysts:A survival strategy in Protozoa Ciliophora［J］.Italian Journal of Zoology，2011，78(2):134-135.

［4］Walker G K，Mangel T K.Encystment and excystment in hypotrich ciliate.Ⅱ.Diophrys scutum remarks on comparative features［J］.Protistologica，1980，16:525-531.

［5］Rios，R M，Torres A.，Calvo P，et al.The cyst of Urostyla grandis(Hypotrichida:Urostylidae):ultrastructure and evolutionary implications［J］.Protistologica，1985，21:481-485.

［6］顧?？?，倪 兵.原生動(dòng)物掃描電鏡樣品制備方法的探討［J］.電子顯微學(xué)報(bào)，1993，12(6):525-529.

［7］Gutiérrez JC，Callejas S，Borniquel S，et al.Ciliate cryptobiosis:a microbial strategy against environmental starvation［J］.International Microbiology，2001，4(3):151-157.

［8］顧福康，倪 兵.包囊游仆蟲休眠包囊的超微結(jié)構(gòu)研究［J］.實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1995，28(2):163-166.

［9］顧?？担?兵，季玲妹，等.魏氏擬尾柱蟲休眠包囊及其細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)的觀察［J］.動(dòng)物學(xué)研究，1999，20(6):206-210.

［10］陳 靈，倪 兵，顧福康.魏氏擬尾柱蟲休眠包囊細(xì)胞器的電鏡酶細(xì)胞化學(xué)研究［J］.動(dòng)物學(xué)研究，2000，21(3):199-203.

［11］顧?？?，倪 兵，楊振云，等.冠突偽尾柱蟲營養(yǎng)期和形成包囊期間細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，2002，48(2):251-257.

［12］顧?？担瑥堊魅?包囊游仆蟲包囊形成和解脫過程中大、小核的研究［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，1992，38(2):208-213.

［13］柳偉君，欒菊敏，俞麗麗，等.偽紅色雙軸蟲皮層色素顆粒和黏液泡的顯微、亞顯微結(jié)構(gòu)觀察［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，48(3):381-385.

［14］章 駿，倪 冰，盛 春，等.大尾柱蟲粘液泡的超微結(jié)構(gòu)觀察［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，46(6):972-975.

［15］Kovács P，Müller WE，Csaba G.A lectin-like molecule is discharged from mucocysts of Tetrahymena pyriformis in the presence of insulin［J］.Journal of Eukaryotic Microbiology，1997，44(5):487-491.

［16］周海英，王正君，生 欣，等.Trichototaxis songi細(xì)胞皮層色素顆粒的顯微和亞顯微觀察［J］.華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，2008(4):66-70.