阻斷p38絲裂原活化蛋白激酶在細(xì)胞空泡形成中的作用＊

張春燕，馮春紅，敬健雄，段春燕，劉友平，夏先明，李 洪，代榮陽(yáng)，陳紹坤

（瀘州醫(yī)學(xué)院：1.生物化學(xué)教研室；2.肝膽外科；3.生物教研室，四川瀘州646000）

為了適應(yīng)環(huán)境變化，細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列諸如皺縮、膨脹、分裂和空泡形成等形態(tài)學(xué)的改變。化學(xué)和生物活性物質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞形成的細(xì)胞質(zhì)空泡是一種顯著且常見(jiàn)的現(xiàn)象［1－2］，此外，細(xì)胞空泡也能自發(fā)形成［3］。細(xì)胞空泡化的程度主要取決于細(xì)胞類型［4－5］，有些細(xì)胞極易發(fā)生空泡化，有些細(xì)胞則很難形成空泡。

有報(bào)道表明［6－7］，細(xì)胞空泡就好比是細(xì)胞內(nèi)幫助消化的酸性區(qū)域。這個(gè)酸性區(qū)域的組成、來(lái)源及形成機(jī)制除了取決于細(xì)胞類型，也取決于細(xì)胞空泡的誘導(dǎo)劑。有學(xué)者認(rèn)為［8－9］，細(xì)胞的自體吞噬介導(dǎo)了空泡形成，細(xì)胞空泡可能代表了某種典型的自體吞噬。但是，有的細(xì)胞空泡并非來(lái)自于自體吞噬，自體吞噬也并非總 是 介 導(dǎo) 空 泡 形 成［10－11］。 也 有 學(xué) 者 認(rèn) 為［12－13］，細(xì) 胞 空泡與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。有些凋亡誘變劑可誘導(dǎo)細(xì)胞空泡化，并通過(guò)空泡形成參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。值得注意的是［14］，有的細(xì)胞空泡并不是因凋亡而產(chǎn)生，有些空泡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)了細(xì)胞空泡形成，但并不引發(fā)細(xì)胞凋亡。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK），如p38MAPK是細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)通路，MAPK通路在細(xì)胞炎癥反應(yīng)、凋亡、生長(zhǎng)和細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。雖然目前已明確細(xì)胞空泡與細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)［15］，但是，細(xì)胞空泡的形成是否受到細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路p38MAPK的調(diào)節(jié)尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)旨在探討p38MAPK是否參與了細(xì)胞空泡形成。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞空泡可在HepG2細(xì)胞中自發(fā)形成，這些空泡可被茴香霉素（Anisomycin）通過(guò)活化p38MAPK而消除。此外，阻斷p38MAPK可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞空泡形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明p38MAPK在調(diào)節(jié)細(xì)胞空泡形成中發(fā)揮了重要作用。

1 材料與方法

1.1 材 料 Anisomycin、放 線 菌 酮 （Cycloheximide，CHX）、SB203580、SP600125購(gòu)自Merck公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑購(gòu)自Gibco公司；β－actin、p－MAPKAPK2、MAPKAPK2、p38MAPK、磷酸化c－Jun抗體購(gòu)自CST公司；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針及溶酶體紅色熒光探針購(gòu)自Invitrogen公司；電泳試劑均購(gòu)自Bio－Rad公司；其他為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 腫瘤細(xì)胞株 HepG2、LM3、QBC939、Hela和A549于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)細(xì)胞分別用anisomycin（0.25、0.5、1.0μg／mL）、SB203580（0、2.5、5.0、10.0 μmol）、SP600125（20nmol）及CHX（5、10、15μmol）處理，并按在對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞空泡化情況。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)p38MAPK等通路相關(guān)分子的表達(dá)水平 HepG2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞蛋白，進(jìn)行 Western blot檢測(cè)?？偟鞍捉?jīng)十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS－PAGE）分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，脫脂奶粉封閉，加Ⅰ抗：β－actin、p－MAPKAPK2、MAPKAPK2、p38MAPK、p－c－jun、c－Jun，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，加Ⅱ抗孵育1h，ECL法顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及溶酶體形態(tài) LM3、A549細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，對(duì)照組用二甲基亞砜（DMSO）做相同處理，用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針和DAPI探針標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，得到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷層掃描圖像；溶酶體紅色熒光探針標(biāo)記溶酶體，得到溶酶體熒光染色圖像，再經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察分析。

2 結(jié) 果

2.1 Anisomycin對(duì)HepG2細(xì)胞空泡的消除作用 實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用不同劑量的p38MAPK和JNK的激活劑Anisomycin（0.25、0.5、1.0μg／mL）作用于 HepG2細(xì)胞12h，對(duì)照組用DMSO做相同處理。光學(xué)顯微鏡下觀察比較，可見(jiàn)Anisomycin對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)自發(fā)形成的空泡有消除作用，呈劑量－效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)圖1A。應(yīng)用0.5μg／mL Anisomycin分別作用于HepG2細(xì)胞0、3、6、12h，該消除作用呈時(shí)間－效應(yīng)關(guān)系，見(jiàn)圖1B。該結(jié)果表明Anisomycin能有效消除HepG2細(xì)胞空泡，p38MAPK和JNK信號(hào)通路可能參與了細(xì)胞空泡化的調(diào)節(jié)。

圖1 Anisomycin對(duì)HepG2細(xì)胞空泡的消除作用（×400）

2.2 Anisomycin通過(guò)活化p38MAPK消除細(xì)胞空泡 p38 MAPK抑制劑（SB）組和JNK抑制劑（SP）組分別應(yīng)用5.0 μmol SB203580、20nmol SP600125作用于 HepG2細(xì)胞12h，對(duì)照組用DMSO做相同處理，Anisomycin組應(yīng)用0.5μmol／mL Anisomycin作用12h，Anisomycin＋SB組和Anisomycin＋SP組分別應(yīng)用5.0μmol SB203580、20nmol SP600125對(duì)HepG2細(xì)胞預(yù)處理1h，再0.5μmol／mL Anisomycin共同作用12h。光學(xué)顯微鏡下觀察比較，可見(jiàn)Anisomycin＋SB組的明顯空泡化，Anisomycin＋SP組與Anisomycin組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2A）。表明SB203580能阻斷Anisomycin對(duì)HepG2細(xì)胞空泡的消除作用，SP600125卻不能阻斷該消除作用。Western blot結(jié)果顯示，Anisomycin對(duì)p38MAPK和JNK的下游效應(yīng)產(chǎn)物p－MAPKAPK2和p－c－jun的表達(dá)水平均有上調(diào)作用。這表明了Anisomycin能活化HepG2細(xì)胞內(nèi)p38 MAPK和JNK通路，SB203580選擇性抑制p38MAPK通路，SP600125選擇性抑制JNK通路。結(jié)果表明Anisomycin是通過(guò)活化p38MAPK消除細(xì)胞空泡。

實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用不同劑量的蛋白合成抑制劑CHX（5、10、15 μmol）作用于HepG2細(xì)胞12h，對(duì)照組用DMSO做相同處理。光學(xué)顯微鏡下觀察比較，CHX不能消除HepG2細(xì)胞空泡，表明Anisomycin對(duì)空泡的消除作用與它的抑制蛋白合成作用無(wú)關(guān)（圖2B）。

2.3 阻斷p38MAPK誘導(dǎo)LM3細(xì)胞空泡形成 應(yīng)用不同劑量的p38MAPK 選擇性抑制劑 SB203580（0、2.5、5.0、10.0 μmol）作用于LM3細(xì)胞12h，誘導(dǎo)空泡形成，呈劑量－效應(yīng)關(guān)系（圖3A）。應(yīng)用5.0μmol SB203580分別作用于LM3細(xì)胞0、6、12、24h，誘導(dǎo)空泡形成，呈時(shí)間－效應(yīng)關(guān)系（圖3B）。該結(jié)果表明阻斷p38MAPK可誘導(dǎo)LM3細(xì)胞空泡形成，呈劑量－時(shí)間雙重效應(yīng)關(guān)系。

圖2 Anisomycin通過(guò)活化p38MAPK消除細(xì)胞空泡（×400）

圖3 阻斷p38MAPK誘導(dǎo)細(xì)胞空泡形成（×200）

2.4 阻斷p38MAPK誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞空泡形成 實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用5.0μmol SB203580分別作用于QBC939、LM3、Hela細(xì)胞12h，對(duì)照組用DMSO做相同處理。光學(xué)顯微鏡下觀察比較，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)大量空泡形成（圖4）。表明阻斷p38 MAPK可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的空泡形成。

2.5 阻斷p38MAPK介導(dǎo)的空泡形成破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的整體性 實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用5.0μmol SB203580分別作用于LM3、A549細(xì)胞12h，對(duì)照組用DMSO做相同處理，進(jìn)行內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針和DAPI探針標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，得到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷層掃描圖像。再經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察分析，顯示對(duì)照組細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)不完整（圖5）。表明阻斷p38MAPK介導(dǎo)的空泡形成破壞了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的整體性。

圖4 阻斷p38MAPK誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞空泡形成（×400）

圖5 阻斷p38MAPK介導(dǎo)的空泡形成破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的完整性

2.6 阻斷p38MAPK形成空泡的泡內(nèi)pH值 應(yīng)用5.0 μmol SB203580分別作用于LM3、A549細(xì)胞12h，進(jìn)行溶酶體紅色熒光探針標(biāo)記溶酶體，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察分析，顯示阻斷p38MAPK形成的空泡之中，只有很少一部分呈現(xiàn)熒光染色（圖6）。表明阻斷p38MAPK形成的空泡，只有少數(shù)的泡內(nèi)pH值為酸性。

圖6 阻斷p38MAPK形成空泡的泡內(nèi)pH值

2.7 阻斷p38MAPK介導(dǎo)的空泡形成具有可逆性 實(shí)驗(yàn)組應(yīng)用5.0μmol SBF203580分別作用于LM3、A549細(xì)胞12h，再換不含SB203580的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6h，對(duì)照組用DMSO做相同處理。光學(xué)顯微鏡下觀察，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組經(jīng)SB203580作用12h，與對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)有大量空泡形成；而換不含SB203580的培養(yǎng)基6h后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)空泡化無(wú)明顯差異（圖7）。表明阻斷p38MAPK介導(dǎo)的空泡形成具有可逆性。

圖7 阻斷p38MAPK介導(dǎo)的空泡形成具有可逆性

3 討 論

細(xì)胞空泡化是發(fā)生在哺乳類動(dòng)物細(xì)胞中常見(jiàn)的形態(tài)學(xué)現(xiàn)象之一。細(xì)胞局部環(huán)境的改變是引起細(xì)胞空泡化的根本原因，細(xì)胞空泡可自發(fā)形成或經(jīng)誘導(dǎo)刺激而形成。但是，細(xì)胞應(yīng)激信號(hào)通路是否參與細(xì)胞空泡化，目前尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在探討p38MAPK通路是否參與了細(xì)胞空泡形成。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK在調(diào)節(jié)細(xì)胞空泡形成中具有重要作用。

應(yīng)用Anisomycin能有效消除HepG2細(xì)胞空泡，因?yàn)锳nisomycin是p38MAPK和JNK的共同激活劑，這就提示p38 MAPK和JNK信號(hào)通路可能參與了細(xì)胞空泡化。由于阻斷p38MAPK可抑制Anisomycin對(duì)細(xì)胞空泡的消除作用，阻斷JNK卻不能抑制Anisomycin的消除作用，提示Anisomycin是通過(guò)活化p38MAPK消除細(xì)胞空泡的，而不是活化JNK。又因Anisomycin是一種蛋白合成抑制劑，為了確認(rèn)它對(duì)空泡的清除作用是否與抑制蛋白合成有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了另一種經(jīng)典的蛋白合成抑制劑CHX作用于HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)CHX不能消除HepG2細(xì)胞空泡，表明Anisomycin對(duì)空泡的消除作用與它的抑制蛋白合成作用無(wú)關(guān)，進(jìn)一步證明了Anisomycin對(duì)空泡的消除作用是通過(guò)活化p38MAPK來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用p38MAPK通路的選擇性抑制SB203580阻斷p38MAPK通路，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞空泡形成，表明阻斷p38MAPK在細(xì)胞空泡形成中發(fā)揮了重要作用。最近有研究報(bào)道［14］SB202190可以不依賴p38MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞空泡形成，分析原因可能是因?yàn)樗眉?xì)胞類型和本實(shí)驗(yàn)不同。細(xì)胞空泡可在HepG2細(xì)胞中自發(fā)形成，卻不能自發(fā)形成于LM3、A549細(xì)胞，可能是不同細(xì)胞類型中p38MAPK的活化情況不同。此外，不同細(xì)胞類型中的p38MAPK通路的功能也不相同，p38MAPK通路并不是惟一調(diào)節(jié)細(xì)胞空泡形成的通路。因此，p38MAPK通路在細(xì)胞空泡化的作用，主要取決于細(xì)胞類型，而p38MAPK活化或阻斷的程度，在很大程度上也取決于細(xì)胞類型。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷層掃描圖像，發(fā)現(xiàn)阻斷p38MAPK介導(dǎo)的空泡形成破壞了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的整體性。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)完整性的破壞提示空泡化可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。已有報(bào)道表明［6－7］，細(xì)胞空泡就好比是細(xì)胞內(nèi)幫助消化的酸性小區(qū)域。本實(shí)驗(yàn)對(duì)阻斷p38MAPK形成的空泡進(jìn)行溶酶體紅色熒光探針標(biāo)記溶酶體，經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察分析，顯示阻斷p38MAPK形成的空泡之中，只有很少一部分呈現(xiàn)熒光染色。表明阻斷p38MAPK形成的空泡，只有少數(shù)的泡內(nèi)pH值為酸性。另外，阻斷p38MAPK可介導(dǎo)空泡形成，當(dāng)去除阻斷劑細(xì)胞空泡則可消除，表明阻斷p38MAPK介導(dǎo)的空泡形成具有可逆性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示p38MAPK在調(diào)節(jié)細(xì)胞空泡形成中的重要作用，p38MAPK在調(diào)節(jié)細(xì)胞空泡形成中的分子機(jī)制有待于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討。

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