宜昌潤楠大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育的研究

韓逸洋+李利平+陳發(fā)菊+楊林森+梁宏偉

摘要：宜昌潤楠（Machilus ichangensis）屬樟科（Lauraceae）潤楠屬（Machilus）植物，常綠喬木，是中國傳統(tǒng)的珍貴優(yōu)質用材樹種。對宜昌潤楠的大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體發(fā)育過程進行了詳細的細胞學觀察。結果表明，宜昌潤楠的雌蕊子房1室，單胚珠，倒生，雙珠被，厚珠心。大孢子母細胞經減數分裂形成直線形排列的4個大孢子，合點端的發(fā)育成功能大孢子，其余3個退化，胚囊發(fā)育類型為蓼型。雄蕊花藥多為二室，少三室、四室花藥，變形絨氈層，小孢子四分體排列為四面體型，成熟花粉為二胞花粉。小孢子有少量敗育及不育現(xiàn)象，雄性不育株絨氈層細胞延遲降解，使小孢子得不到營養(yǎng)而不能正常發(fā)育，最后敗育。

關鍵詞：宜昌潤楠（Machilus ichangensis）；大、小孢子發(fā)生；雌、雄配子體發(fā)育；敗育

中圖分類號：S718.43文獻標識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2352-04

The Megasporogenesis，Microsporogenesis，F(xiàn)emale and Male Gametophyte Development of Machilus ichangensis

HAN Yi-yang1，LI Li-ping1，CHEN Fa-ju1，YANG Lin-sen2，LIANG Hong-wei1

（1.Biotechnology Research Center，China Three Gorges University，Yichang 443002，Hubei，China；

2.Bureau of Shennongjia National Nature Reserve，Shennongjia 442421，Hubei，China）

Abstract： Machilus ichangensis Rehd.et Wils is an unique high-quality timber species belonging to Lauraceae Machilus. The megasporogenesis，microsporogenesis and development of male and female gametophytes in the flower of Machilus ichangensis were observed at cellular level. The results showed that the ovary of Machilus ichangensi had 1-locules，with single ovule.The ovule was anatropous，bitegmic and crassinucellate with the endothelium.The megaspore mother cell formed a linear tetrad of 4 megaspores after meiosis. The chalazal megaspore developed the functional one and the other 3 at the micropylar pole were degraded. The development of embryo sac was of polygonum type. There were 2-locules，3-locules and 4-locules anther sac in flowers. The tapetum was amoeboid. The microspores tetrad was arranged in a tetrahedral. The mature pollen grains were of 2-celled types. There were little pollen abortion and male sterility since the tapetum of male sterile plants delayed degradation and the microspores could not obtain enough nutrition for normal development.

Key words：Machilus ichangensis；megasporogenesis and microsporogenesis；male and female gametophytes development；abortion

基金項目：國家科技支撐計劃課題（2013BAD03B03）

宜昌潤楠（Machilus ichangensis）屬樟科（Lauraceae）潤楠屬（Machilus）毛花組中的黃心樹亞組[1]常綠闊葉喬木，是中國特有珍稀植物，產于湖北、四川、陜西、甘肅，生長在海拔560～1 400 m的山坡或山谷的疏林內。宜昌潤楠不僅樹干通直，樹姿優(yōu)美，是良好的觀賞綠化樹種，且其木材優(yōu)良，樹皮可作褐色染料，種子油可制肥皂、潤滑油等，具有潛在的輕工業(yè)利用前景。

對宜昌潤楠的研究目前僅限于生理生態(tài)[2，3]、化學成分[4]的研究，更多的是關于潤楠屬[5-7]、潤楠[8-12] 的分類及雄配子體超微結構的研究。而對宜昌潤楠鮮有報道。本研究在前人研究的基礎上，對宜昌潤楠花發(fā)育過程中，大、小孢子發(fā)生及雌、雄配子體的形成過程進行了詳細的細胞學觀察和研究，旨在為該種資源保護、良種繁育和系統(tǒng)進化研究提供生殖生物學方面的基礎資料。

1材料與方法

用于細胞學研究的宜昌潤楠花芽材料采自湖北省五峰縣仁和坪鎮(zhèn)。將不同發(fā)育時期的宜昌潤楠花芽固定于FAA固定液中，固定24 h后轉入70%乙醇中保存在4 ℃冰箱備用。采用常規(guī)石蠟切片法切片。Laica切片機連續(xù)切片，切片厚度為8 μm。番紅、固綠對染法進行染色，逐級脫水透明封片，Nikon ECLIPSE 80i型顯微鏡觀察照相。

2結果與分析

2.1小孢子發(fā)生及雄配子體的形成

2.1.1花藥壁的發(fā)育宜昌潤楠為圓錐花序，從花藥橫切面看，雄蕊9枚，外輪6枚，內輪3枚（圖1-11）。宜昌潤楠的花藥有2室花粉囊、3室花粉囊和4室花粉囊，且2室花粉囊居多，有一字型排列花粉囊和蝶形花粉囊（圖1-14）。在小孢子造孢細胞時期，花藥壁開始分化，依次形成表皮、藥室內壁、2～3層中層和絨氈層，細胞之間排列緊密（圖1-2）。隨著次生造孢細胞的發(fā)育，花藥壁層次清晰，且絨氈層質濃（圖1-3）。當小孢子母細胞形成時，絨氈層細胞體積變大，質濃，細胞形狀規(guī)則，排列緊密，且中層在早期呈現(xiàn)出退化趨勢（圖1-4）。在小孢子四分體時期及剛釋放的小孢子時期，絨氈層開始脫離花藥壁，細胞之間排列疏松，此時中層只剩殘跡，表皮細胞與藥室內壁細胞仍緊密排列，方形（圖1-6）。在小孢子變圓的階段，小孢子周圍出現(xiàn)周原生質團（圖1-7，圖1-9），包裹著每個小孢子，故宜昌潤楠的絨氈層屬于變形絨氈層。當小孢子發(fā)育成熟時，周原質團已被吸收殆盡，中層仍留殘跡，藥室內壁開始纖維化，表皮緊貼藥室內壁（圖1-10）。散粉時期，花藥從兩側開裂，花藥壁脫落（圖1-13）。

2.1.2小孢子發(fā)生及雄配子體的形成 在花粉囊壁發(fā)育的同時，宜昌潤楠的初生造孢細胞發(fā)育為次生造孢細胞，次生造孢細胞呈多邊形，細胞排列緊密，核大，質濃，有較大液泡位于細胞中央（圖1-2）。緊接著次生造孢細胞進一步發(fā)育為小孢子母細胞，形狀變圓，質濃，細胞核被液泡擠向一邊（圖1-4）。隨后小孢子母細胞進行1次減數分裂，形成正四面體形四分體，排列緊密（圖1-5）。四分體釋放的小孢子形狀不規(guī)則，被原生質團絨氈層包圍，隨后小孢子體積開始增大，形狀變圓。在雄配子體發(fā)育的過程中，有花粉敗育現(xiàn)象，敗育的花粉細胞質空癟，最后只剩下空的花粉壁（圖1-7）?？捎ǚ奂毎麍A潤，單核期細胞質濃，周圍外壁仍有胼胝質，小孢子核經過一次有絲分裂，形成成熟的二核花粉，被液泡擠向一邊的核叫生殖核，位于細胞中央較大的核為營養(yǎng)核（圖1-12）。在切片時發(fā)現(xiàn)宜昌潤楠少量的雄性不育現(xiàn)象，在四分體釋放小孢子后，絨氈層不能脫離花粉囊壁，細胞內的自溶物不能及時為小孢子提供營養(yǎng)，小孢子形狀線性，空癟（圖1-15），最后與絨氈層一起降解，形成一條顏色很深的帶（圖1-16）。

2.2大孢子發(fā)生及雌配子體的形成

宜昌潤楠子房一室，單胚珠，倒生，雙珠被，厚珠心。在早期的珠心組織中，珠心頂端表皮下3～4層細胞分化為2個孢原細胞，核大，質濃（圖2-1、圖2-2）。隨后孢原細胞經過一次平周分裂形成一個造孢細胞和一個周緣細胞，但僅一個造孢細胞分化成為大孢子母細胞。由于胚珠兩側生長速度不一致，不久一側分裂生長較快的發(fā)生彎曲，導致胚珠倒生，內珠被生長快于外珠被（圖2-3）。大孢子四分體排列直線型（圖2-4），且靠近合點端的一個成為功能大孢子，其余3個退化。隨后功能大孢子先形成單核胚囊（圖2-5），單核胚囊經過3次有絲分裂分別形成二核胚囊（圖2-6）、四核胚囊（圖2-7）、八核胚囊（圖2-8）。在雌配子體形成的過程中，囊腔逐漸擴大，在成熟胚囊時達到最大（圖2-4～9）。由于胚囊中的細胞并不位于同一平面，所以在不同的切片中才能觀察到特殊細胞。位于珠孔端的卵細胞體積最大，核大，質濃（圖2-9），與2個助細胞成梨形狀（圖2-10）。中央極核位于胚囊中央（圖2-11），反足細胞位于合點端，3個細胞構成“品”字形排列。

3討論

宜昌潤楠為樟科潤楠屬，其胚胎學特征基本上與樟科和潤楠屬的胚胎學特征相符合。胚珠倒生，雙珠被，厚珠心，大孢子四分體直線型，靠近合點端發(fā)育為功能大孢子，胚胎發(fā)育為蓼型，與樟科基本特征一致[13-16]。在郭建民等[8]的潤楠屬胚胎學的報道中孢原細胞起源于珠心表皮3～4層細胞之下，且雌性孢原細胞多個相一致。樟科植物的絨氈層有腺質絨氈層，也有變形絨氈層[13]。而潤楠屬[9，12]與宜昌潤楠的切片中都表現(xiàn)出變形絨氈層的特征，在四分體解體后絨氈層細胞向藥室腔內移動，在小孢子周圍形成周原質團?；趥鹘y(tǒng)形態(tài)學特征，花藥室數目曾經被作為樟科分類依據，而現(xiàn)在花藥數目是一個可變而缺乏穩(wěn)定的形態(tài)特征，同一屬內的不同種類間藥室數目也是不穩(wěn)定的[17]。在Kweon等[13，14]對樟科的報道中指出花藥有2室和4室，取決于哪個屬哪個科，未見3室報道。而在宜昌潤楠中，一朵花中同時存在2室、3室、4室花粉囊，以2室花粉囊居多。這可能跟取材的野生宜昌潤楠有關，在屬間或種間出現(xiàn)了一定的變異。

從大量切片中觀察到，不同花的花粉囊或同一朵花中不同花粉囊發(fā)育不同步，在四分體解體后，同一花中的不同藥室發(fā)育高度同步。雌蕊與雄蕊的發(fā)育基本同步。在連續(xù)切片中可以看到，小孢子在四分體及之前的時期，數量居多，在小孢子成熟的過程中，有部分敗育現(xiàn)象，細胞空癟，出現(xiàn)異常，最終導致花粉量的減少，有性生殖能力降低。在部分花的發(fā)育中仍可見雄性不育現(xiàn)象，在小孢子從四分體釋放出來后，絨氈層沒有進入到花粉囊中，而在原位延遲降解，導致小孢子過度收縮變形，不能進行正常的液泡化，不能正常地進行有絲分裂而形成空的花粉囊。在雄性不育的報道中，絨氈層的異常通常是其普遍因素。高粱不育系[18]的花藥絨氈層細胞存在過度發(fā)育和液泡化的異?，F(xiàn)象；其次在玉米[19]、蘿卜[20]、水稻[21]等雄性不育細胞學研究中也均發(fā)現(xiàn)了絨氈層的遲緩消失等異?，F(xiàn)象。由此可見，絨氈層不能及時降解致使宜昌潤楠的雄蕊在分化過程中出現(xiàn)敗育現(xiàn)象，使其繁殖能力低下，也是宜昌潤楠種群數量稀少的部分原因?？梢赃M一步通過生物化學、分子生物學等現(xiàn)代生物技術對其進行探究，以探索制約宜昌潤楠自我更新繁育的其他關鍵環(huán)節(jié)和關鍵因子或尋找致使其絨氈層自身溶解延遲的相關基因，從而通過人工干預，尋求提高該物種繁育能力的有效方法。

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