環(huán)磷酰胺對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎的療效觀察

王兵

葡萄膜炎病因復(fù)雜，類型繁多，主要累及葡萄膜、視網(wǎng)膜血管、視網(wǎng)膜及玻璃體等組織，占致盲眼病的第3～7位[1]，葡萄膜炎病程較長，主要發(fā)生于青壯年，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，危害性很大[2]，環(huán)磷酰胺對CD4淋巴細(xì)胞有明顯抑制作用，并通過抑制體液免疫降低了外周淋巴細(xì)胞IL-17的表達(dá)[3]從而起到治療葡萄膜炎的作用。本研究通過對比分析環(huán)磷酰胺治療EAU的資料，來探討環(huán)磷酰胺對EAU治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級雄性動(dòng)物L(fēng)ewis大鼠54只,周齡6～8周，體重150～180g(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)。所有動(dòng)物均按照視覺與眼科學(xué)研究協(xié)會(huì)中關(guān)于使用動(dòng)物進(jìn)行眼科與視覺研究的要求進(jìn)行飼養(yǎng)和處理。使用過程中遵循天津市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 主要試劑和儀器 牛S抗原，蘇木精液；PH7.4，0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)；聚合HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、DAB；弗氏完全佐劑(complete Freund adjuvant， CFA)；白喉-破傷風(fēng)-百日咳菌苗；規(guī)格為1.5ml Eppendorf管；裂隙燈顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympic公司BX51型400倍光學(xué)顯微鏡)；電腦全自動(dòng)組織脫水機(jī)；濃度20g/L環(huán)磷酰胺液。

1.3 方法

1.3.1 誘導(dǎo)劑的配置 誘導(dǎo)劑的配置：取15mg牛S抗原溶解于15ml PBS緩沖液中，過濾、除菌，抽取等量濃度為lmg/ml的牛S抗原溶液與弗氏完全佐劑混勻乳化?；靹?h后，將乳化成功的溶液放置于冰塊上，待用。

1.3.2 EAU模型制作和分組 采用隨機(jī)數(shù)字法將所有大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和正常對照組，其中實(shí)驗(yàn)組大鼠48只，正常對照組6只。實(shí)驗(yàn)組：取30μg制備好的誘導(dǎo)液，在大鼠雙后足墊皮內(nèi)注射，同時(shí)腹腔內(nèi)注射白喉-破傷風(fēng)-百日咳菌苗0.1ml。正常對照組：在大鼠雙后足墊皮內(nèi)注射等量的生理鹽水。造模3d后每天裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠眼內(nèi)炎癥反應(yīng)情況，判斷造模是否成功。

1.3.3 環(huán)磷酰胺治療 采用隨機(jī)數(shù)字法將實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)平均分為環(huán)磷酰胺組和空白對照組，各24只。環(huán)磷酰胺組：大鼠于造模成功后每天相同時(shí)間點(diǎn)，在大鼠尾靜脈注射1ml環(huán)磷酰胺(20g/L)，連續(xù)注射3d；空白對照組：大鼠于造模成功后每天相同時(shí)間點(diǎn)，在大鼠尾靜脈注射1ml生理鹽水，連續(xù)注射3d，根據(jù)Caspi[4]臨床分級進(jìn)行評分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，眼內(nèi)炎癥反應(yīng)臨床分級評分以中位數(shù)和四分位數(shù)表示，采用非參數(shù)Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。其余數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，采用單因素方差分析和兩隨機(jī)樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠眼前節(jié)裂隙燈顯微鏡觀察炎癥反應(yīng)情況和Caspi臨床分級評分 正常對照組：發(fā)現(xiàn)房水清、虹膜紋理清晰、瞳孔圓、對光反射良好，未見明顯異常；其Caspi臨床分級評分均為0級。

空白對照組：造模后6天開始出現(xiàn)EAU炎癥癥狀，此時(shí)觀察到主要的炎癥表現(xiàn)為房水閃輝、晶狀體前囊灰白色點(diǎn)狀沉著物、虹膜血管輕度充血、擴(kuò)張等；造模后9天 EAU炎癥癥狀加重，主要的炎癥表現(xiàn)為房水閃輝加重，瞳孔對光反射消失、瞳孔縮小等；造模后12天 EAU炎癥癥狀最嚴(yán)重，主要的炎癥表現(xiàn)為前房變淺甚至消失、瞳孔發(fā)生閉鎖、前房積膿，能擴(kuò)大瞳孔者可見玻璃體內(nèi)密集的團(tuán)狀混濁；造模后第15天 EAU炎癥癥狀有所減輕；造模后第18天炎癥癥狀明顯減輕。

環(huán)磷酰胺組：造模后第8天開始出現(xiàn)EAU炎癥癥狀，隨后炎癥反應(yīng)逐漸加重，至造模后第12天最重，其后逐漸減輕，造模后第18天 EAU炎癥癥狀明顯減輕，但各時(shí)間點(diǎn)的嚴(yán)重程度明顯低于空白對照組。

2.2 空白對照組和環(huán)磷酰胺組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠Caspi臨床分級評分比較 見表1。環(huán)磷酰胺組造模后第6、9、12和18天大鼠眼內(nèi)炎癥反應(yīng)Caspi臨床分級評分均顯著低于空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而正常對照組Caspi臨床分級評分均為0級。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)大鼠Caspi臨床分級評分比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)提示牛S-Ag和CFA等量混合可成功誘導(dǎo)Lewis大鼠成功制造EAU模型。其機(jī)制可能為牛S-Ag和CFA等量混合抗原可誘導(dǎo)反應(yīng)性T細(xì)胞大量增殖為Thl或Thl7細(xì)胞，這些激活的效應(yīng)T細(xì)胞隨血流到達(dá)眼內(nèi)組織，識別與其同源的抗原，并激活下游信號，導(dǎo)致血眼屏障的破壞，炎癥細(xì)胞的浸潤繼而炎癥發(fā)展為葡萄膜炎[5]。

大鼠眼前節(jié)裂隙燈顯微鏡下觀察，空白對照組免疫第6d開始出現(xiàn)EAU炎癥癥狀、12天 EAU炎癥癥狀最嚴(yán)重、造模后15天 EAU炎癥癥狀有所減輕、造模后第18天 EAU炎癥癥狀明顯減輕。環(huán)磷酰胺組造模后第8天開始出現(xiàn)EAU炎癥癥狀，隨后炎癥反應(yīng)逐漸加重，至造模后12天最重，其后逐漸減輕，造模后第18天 EAU炎癥癥狀明顯減輕，但各時(shí)間點(diǎn)的嚴(yán)重程度明顯低于空白對照組。說明造模成功后12天 EAU病情最嚴(yán)重，眼內(nèi)炎癥反應(yīng)達(dá)到最高峰。隨時(shí)間推移兩組都在18天趨向好轉(zhuǎn)，說明EAU具有自限性，印證了葡萄膜炎是自身免疫性疾病這一觀點(diǎn)。在不同時(shí)間點(diǎn)環(huán)磷酰胺組的炎癥反應(yīng)及均低于空白對照組，說明環(huán)磷酰胺能抑制EAU反應(yīng)過程中炎性介質(zhì)的釋放。其機(jī)制可能為抑制CD4+細(xì)胞亞群CD17細(xì)胞的細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)，抑制了葡萄膜炎的發(fā)生、發(fā)展[6]。

環(huán)磷酰胺是一種烷化劑，是應(yīng)用最廣的氮芥類衍生物，代謝在肝臟進(jìn)行，其不良反應(yīng)主要為肝功能、腎功能損壞、出血性膀胱炎、血細(xì)胞異常等，臨床上多用于抗腫瘤治療。

研究表明，環(huán)磷酰胺對CD4淋巴細(xì)胞有明顯抑制作用[7]，并通過抑制體液免疫降低了外周淋巴細(xì)胞的表達(dá)，可以治療非感染性和多種類型的難治性葡萄膜炎，主要用于糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑無反應(yīng)的頑固性眼病患者[8]，本研究選取環(huán)磷酰胺，考慮其能通到免疫學(xué)機(jī)制影響葡萄膜炎的進(jìn)程，減輕大鼠葡萄膜炎病變程度，改善葡萄膜炎病情。其原因可能為環(huán)磷酰胺通過與DNA鳥嘌呤的第七位氮發(fā)生持久的交叉打結(jié)，導(dǎo)致DNA編碼錯(cuò)誤，使細(xì)胞的DNA在分裂過程中不能分裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]。

總之，雖然環(huán)磷酰胺能夠減輕大鼠葡萄膜炎病變程度，改善葡萄膜炎病情，為我們治療葡萄膜炎提供了新的治療方法。

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[3]袁立飛，張曉敏，李光速，等.間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎視網(wǎng)膜中白細(xì)胞介素17表達(dá)的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2012，30(5)：392-396.

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[5]唐搖紅，蔡莉萍，張愉.調(diào)節(jié)T細(xì)胞與葡萄膜炎的研究進(jìn)展[J].國際眼科雜志，2011，11(3)：450-452.

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