真菌黃曲霉對(duì)氟磺胺草醚的最佳降解條件研究

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(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

真菌黃曲霉對(duì)氟磺胺草醚的最佳降解條件研究

崔文娟1,鄒月利1,*,陶波2,*,孫寧1,趙迪1,朱美華1,張如如1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150030)

采用高效液相色譜法測(cè)定真菌黃曲霉在不同條件下對(duì)氟磺胺草醚的降解效率,確立降解菌株黃曲霉(TZ1985)對(duì)氟磺胺草醚的最佳降解條件。結(jié)果表明：在不調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH條件下,當(dāng)氟磺胺草醚的濃度為10mg/L、黃曲霉接種量為3%的菌懸母液、溫度為25℃、振蕩培養(yǎng)5d時(shí),真菌黃曲霉菌株可以降解92.5%以上的氟磺胺草醚。

氟磺胺草醚,黃曲霉,液相色譜,降解條件

氟磺胺草醚(Fomesafen)又稱虎威,是由英國(guó)捷利康公司開(kāi)發(fā)的二苯醚類除草劑?；瘜W(xué)名稱為:5-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氧基]-N-(甲磺酰基)-2-硝基苯甲酰胺[1-2]；氟磺胺草醚為無(wú)色晶體,是一種具有高度選擇性的大豆、花生田苗后除草劑,能有效地防除大豆、花生田闊葉雜草和香附子,對(duì)禾本科雜草也有一定的防效[3]。氟磺胺草醚在土壤中持效期長(zhǎng),用藥量偏高,對(duì)第二年種植敏感作物,如白菜、谷子、高粱、甜菜、玉米、小米、亞麻等均有不同程度藥害；極大地限制了大豆和花生產(chǎn)區(qū)合理的作物輪作,嚴(yán)重影響種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整,對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的損失[4-6]。除草劑在土壤中主要通過(guò)光解、水解、微生物降解等降解方式,其中微生物降解起著非常重要的作用。環(huán)境的pH、溫度、濕度和土壤中的礦物質(zhì)等均能影響微生物降解除草劑的除草活性[7-8]。近些年人們通過(guò)篩選和富集,分離得到的能夠降解氟磺胺草醚的微生物主要是曲霉屬和酵母屬真菌、芽孢桿菌屬細(xì)菌和鏈霉屬放線菌[9-11]。國(guó)內(nèi)外研究表明,微生物降解除草劑對(duì)環(huán)境安全、無(wú)毒,尤其是在水和土壤環(huán)境中降解效果十分顯著[12-13]。實(shí)驗(yàn)利用科研室篩選出能夠高效降解氟磺胺草醚的真菌黃曲霉(Aspergillusflavus)對(duì)在不同培養(yǎng)條件下的氟磺胺草醚除草劑降解特性進(jìn)行深入的研究,利用高效液相色譜法定量檢測(cè),確定真菌黃曲霉對(duì)氟磺胺草醚除草劑的最佳降解條件,為生物治理該類除草劑的殘留提供有效途徑[14-15]。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

甲醇 美國(guó)迪馬公司；二氯甲烷 科密歐公司,均為色譜純；氟磺胺草醚標(biāo)準(zhǔn)品 購(gòu)自江蘇常青農(nóng)藥有限公司,其純度為98.0%；真菌黃曲霉(Aspergillusflavus) 為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)與雜草學(xué)教研室自行篩選、保存的高效降解菌株TZ1985。

Agilent 1260高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技發(fā)展有限公司；Z36HK超速冷凍離心機(jī) 德國(guó)HERMLE儀器公司；YGC-12D圓形氮吹儀 鄭州寶晶電子科技有限公司；BS124S分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;AP-01P真空抽濾機(jī) 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；0.22μm微孔濾膜 上海市新亞凈化器件廠生產(chǎn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜條件的選擇 高效液相色譜采用反向色譜柱：Agilent-ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm,5.0μm)；紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)設(shè)定：290nm；流動(dòng)相配比：甲醇和水(pH=3,用36.5% 醋酸調(diào)節(jié))的比例為70∶30；流速：1.0mL/min；柱溫設(shè)定：30℃；進(jìn)樣體積：10μL。

1.2.2 培養(yǎng)基配制的方法 PDA斜面培養(yǎng)基：取馬鈴薯200g,洗凈去皮后切碎,加水煮沸30min,用斜面菌種的培養(yǎng)紗布過(guò)濾后加入20g葡萄糖和15g瓊脂,蒸餾水1000mL,121℃高壓滅菌15min。

查氏(基礎(chǔ))培養(yǎng)基：葡萄糖20g,FeSO40.01g,MgSO4·7H2O 0.5g,KCl 0.5g,NaNO32.0g,瓊脂20g,K2HPO41.0g,再加入蒸餾水1000mL,在121℃條件下高溫高壓滅菌20min[13-14]。

1.2.3 氟磺胺草醚的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確稱量純度為98.0%的氟磺胺草醚除草劑0.1020g于燒杯中,加入一定量的色譜甲醇溶液使之充分溶解,轉(zhuǎn)移至250mL的容量瓶中,定容到刻度線,得到濃度為400.0mg/L的氟磺胺草醚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用流動(dòng)相稀釋成濃度依次為：0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8、10、40、80、120mg/L氟磺胺草醚標(biāo)準(zhǔn)溶液,最后用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 真菌黃曲霉最佳降解條件的確定 分別向250mL錐型瓶?jī)?nèi)裝入100mL一定pH的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,在121℃條件下高溫滅菌1.5h。再向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入一定量的氟磺胺草醚儲(chǔ)備液,使其成為不同濃度的反應(yīng)液。然后再接種一定量的黃曲霉種子液,以不加黃曲霉種子液作為對(duì)照,每組設(shè)置3個(gè)重復(fù),將錐型瓶置于130r/min的搖床上在一定溫度條件下避光振蕩培養(yǎng)一定時(shí)間。

1.2.4.1 氟磺胺草醚的濃度對(duì)降解作用影響 分別加入氟磺胺草醚儲(chǔ)備液,使其分別成為1、5、10、50和100mg/L濃度的反應(yīng)液,進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)；考察氟磺胺草醚的濃度對(duì)降解作用影響。

1.2.4.2 培養(yǎng)基中的溫度對(duì)降解作用影響 分別在20、25、30和35℃條件下,進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)；考察培養(yǎng)基中的溫度對(duì)降解作用影響。

1.2.4.3 真菌黃曲霉的接種量對(duì)降解作用影響 分別加入1%、2%、3%、4%、5%的黃曲霉菌懸母液,進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)；考察真菌黃曲霉的接種量對(duì)降解作用影響。

1.2.4.4 培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)降解作用影響 每隔0、1、3、5、7、10d取樣,用液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)；考察培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)降解作用影響。

1.2.4.5 不同pH的培養(yǎng)基對(duì)降解作用影響 使基礎(chǔ)培養(yǎng)基中溶液pH分別為5、7、9,以不調(diào)節(jié)pH為對(duì)照,進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)；考察不同pH的培養(yǎng)基對(duì)降解作用影響。

1.2.5 氟磺胺草醚除草劑降解率的測(cè)定 將反應(yīng)液每隔一定的時(shí)間,在無(wú)菌操作臺(tái)上取樣5.0mL降解液,在12000r/min、4℃條件下離心15min后取上清液3.0mL,加1.0g左右的固體氯化鈉(防止乳化),搖勻、使之完全溶解后,加5.0mL(3.0+2.0)二氯甲烷萃取2次、合并有機(jī)層；加0.5g左右的無(wú)水硫酸鈉干燥,取上清液用氮?dú)獯蹈?用甲醇溶液定容至1.0mL。最后用0.22μm的有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾,在高效液相色譜儀上進(jìn)行測(cè)定氟磺胺草醚除草劑的降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1方法的線性

根據(jù)液相色譜法的測(cè)定結(jié)果,以氟磺胺草醚除草劑的濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1)。得到線形回歸方程為：y=25.933x-0.867,相關(guān)系數(shù)為：R2=0.9997(n=3)。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,氟磺胺草醚除草劑在0.1～120mg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 氟磺胺草醚除草劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2真菌黃曲霉的最佳培養(yǎng)條件確立

2.2.1 氟磺胺草醚的濃度對(duì)降解作用影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中黃曲霉接種量為3%的菌懸母液,溫度為25℃,待反應(yīng)液培養(yǎng)5d,測(cè)定不同濃度氟磺胺草醚的降解曲線(如圖2)表明：真菌黃曲霉菌株在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中是以氟磺胺草醚為唯一碳源和氮源的微生物,所以對(duì)不同濃度的氟磺胺草醚的降解率存在較大差異。其中對(duì)濃度為5、10和50mg/L氟磺胺草醚的降解能力明顯高于濃度為1和100mg/L氟磺胺草醚的降解率；當(dāng)氟磺胺草醚含量為10mg/L時(shí)降解率最高,為92.53%。

圖2 氟磺胺草醚的濃度對(duì)降解作用影響

2.2.2 培養(yǎng)基中的溫度對(duì)降解作用影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入濃度為10mg·L-1氟磺胺草醚,黃曲霉接種量為3%的菌懸母液,待反應(yīng)液培養(yǎng)5d時(shí)的降解曲線(如圖3)表明：不同溫度對(duì)黃曲霉的降解速率影響較大,反應(yīng)液的溫度為20℃時(shí),氟磺胺草醚的降解率為90.41%；當(dāng)溫度為25℃時(shí)降解率最高,為92.5%；所以實(shí)驗(yàn)選取的培養(yǎng)溫度為25℃。以上結(jié)果表明,溫度過(guò)低或者過(guò)高均會(huì)抑制該菌株對(duì)氟磺胺草醚的降解。因此,選擇合適的降解溫度對(duì)提高降解率具有很大意義。

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)降解作用影響

2.2.3 真菌黃曲霉的接種量對(duì)降解作用影響 微生物的數(shù)量是影響黃曲霉降解能力的重要因素之一,向氟磺胺草醚濃度為10.0mg·L-1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接種不同菌量的菌懸母液,在25℃條件下振蕩培養(yǎng)5d時(shí)測(cè)定氟磺胺草醚的降解率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(如圖4),當(dāng)真菌黃曲霉的接種量為3%的菌懸母液時(shí)對(duì)氟磺胺草醚降解速率最大,為93.47%。

圖4 真菌黃曲霉的接種量對(duì)降解作用影響

2.2.4 培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)降解作用影響 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入濃度為10mg·L-1氟磺胺草醚,黃曲霉接種量為3%的菌懸母液,溫度為25℃,將反應(yīng)液每隔0、1、3、5、7、10d測(cè)定氟磺胺草醚的降解率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(如圖5)：培養(yǎng)5d時(shí)降解率為95.36%,培養(yǎng)10d時(shí)的降解率為98.64%。因此,黃曲霉菌株在培養(yǎng)到5d即可將氟磺胺草醚基本降解完全。

圖5 培養(yǎng)的時(shí)間對(duì)降解作用影響

2.2.5 不同pH的培養(yǎng)基對(duì)降解作用影響 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中反應(yīng)液的pH是影響氟磺胺草醚降解的一個(gè)非常重要因素。使基礎(chǔ)培養(yǎng)基中溫度為25℃,濃度為10mg·L-1氟磺胺草醚,黃曲霉接種量為3%的菌懸母液,將反應(yīng)液每隔0、1、3、5d測(cè)定氟磺胺草醚除草劑的降解曲線(如圖6)表明：在對(duì)照培養(yǎng)基中氟磺胺草醚降解率最高,在pH為5、7和9的反應(yīng)液中降解速率基本相同,以上結(jié)果表明,對(duì)照培養(yǎng)基中黃曲霉對(duì)氟磺胺草醚的降解速率最快。因此,選擇合適的pH對(duì)提高降解率有很大意義。

圖6 不同pH的培養(yǎng)基對(duì)降解作用影響

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)確立了真菌黃曲霉在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中對(duì)氟磺胺草醚除草劑最適宜的降解條件：在不調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH條件下,氟磺胺草醚濃度為10mg/L、溫度為25℃、黃曲霉接種量為3%的菌懸母液,培養(yǎng)時(shí)間為5d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該菌株適應(yīng)一般的環(huán)境條件下,即可以對(duì)氟磺胺草醚除草劑起到較好的降解作用,為以后人們研究其它菌株對(duì)該類除草劑的降解提供了理論依據(jù)。

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Research of optimum degradation conditions of fomesafen byAspergillusflavus

CUIWen-juan1,ZOUYue-li1,*,TAOBo2,*,SUNNing1,ZHAODi1,ZHUMei-hua1,ZHANGRu-ru1

(1. College of Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2. College of Agricluture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

In this paper,high performance liquid chromatography(HPLC)was used to determine the degradation rate of fomesafen under different conditions. The optimum degradation condition of fomesafen was obtained byAspergillusflavus(TZ1985). The optimum conditions for the fomesafen degradation without adjusting pH condition were found as follows:concentration of fomesafen 10mg/L,inoculum volume of bacteria suspension 3%,temperature 25℃,shaking for 5d and the degradation rate was 92.5%.

fomesafen;Aspergillusflavus;liquid chromatography;degradation conditions

2013-06-25 *通訊聯(lián)系人

崔文娟(1992-),女,本科,研究方向:除草劑降解及殘留檢測(cè)。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(2013063)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30971834)。

TS201.3

：A

：1002-0306(2014)01-0178-04