穩(wěn)轉(zhuǎn)STAT6-RNAi細胞株的構(gòu)建及功能鑒定

張玉山,高國生

(1.南陽市中心醫(yī)院 感染科,河南 南陽 473000;2.寧波市感染病醫(yī)院 肝病科,浙江 寧波 315000)

穩(wěn)轉(zhuǎn)STAT6-RNAi細胞株的構(gòu)建及功能鑒定

張玉山1,高國生2

(1.南陽市中心醫(yī)院 感染科,河南 南陽 473000;2.寧波市感染病醫(yī)院 肝病科,浙江 寧波 315000)

目的 探討RNAi慢病毒載體對HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株增殖、遷移的影響。方法 感染實驗分為4組:空白對照組（未經(jīng)處理的HepG2細胞)，陰性對照組（只感染 pLVTHm空病毒)，感染pLVTHm-STAT6-RNAi組，感染pLVTHm-STAT6-ORF組。運用病毒感染HepG2細胞獲得穩(wěn)定表達STAT6-ORF和STAT6-RNAi的細胞株，利用PCR和Western blot的方法檢測穩(wěn)定細胞株中STAT6的表達豐度。CCK-8法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株的細胞活性及Transwell實驗檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞遷移能力變化。結(jié)果 通過TET的篩選，成功獲得了STAT6-ORF以及STAT6-RNAi的HepG2穩(wěn)定表達細胞株。與對照組細胞相比，過表達STAT6-ORF轉(zhuǎn)染的細胞增殖快（F=4.279，P=0.021)，遷移率高；而STAT6-RNAi轉(zhuǎn)染后，細胞增殖緩慢，隨培養(yǎng)時間延長及傳代（HepG2傳到第三代細胞絕大部分細胞已經(jīng)死亡)，細胞逐漸崩解、漂浮死亡，細胞活性顯著降低（F=290.114，P＜0.001)，遷移能力顯著下降。結(jié)論 成功構(gòu)建STAT6-RNAi和STAT6-ORF穩(wěn)定株，為后期建立動物模型，體內(nèi)驗證STAT6的生物學(xué)功能奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

慢病毒包裝；STAT6 RNAi干涉；感染；HepG2細胞

原發(fā)性肝癌(primary hepatic cancer,PHC)是一種原發(fā)于膽管細胞或肝細胞的癌癥,是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,全球發(fā)病率居惡性腫瘤第五位。近年來,隨著環(huán)境因素和社會因素的改變,肝癌的發(fā)病率也明顯提高,而且患者年齡呈年輕化趨勢。研究表明,腫瘤細胞及其周圍免疫細胞分泌的炎性因子可激活炎癥相關(guān)信號通路,誘導(dǎo)腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成,參與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的過程。本研究擬通過構(gòu)建STAT6-RNAi和STAT6-ORF穩(wěn)定株,探討RNAi慢病毒載體對HepG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株增殖、遷移的影響,為后期建立動物模型,驗證STAT6的生物學(xué)功能提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株:人肝癌HepG2細胞株,由南方醫(yī)科大學(xué)基因工程研究所提供。

1.1.2 主要試劑:PrimerScriptTMRT-PCR試劑盒、DL2000標準分子量、Taq DNA聚合酶、Trizol試劑為大連TaKaRa公司產(chǎn)品;DMEM培養(yǎng)液、胰酶,為美國GIBCO公司產(chǎn)品;胎牛血清,杭州四季清公司;CCK-8試劑,廣州展辰生物公司;聚凝胺(polybrene),美國Sigma公司;二甲亞楓(DMSO),上海生工生物公司;聚偏二氟乙烯膜,美國Millipore公司;STAT6羊抗兔單克隆抗體,美國Epitomics公司;GAPDH羊抗鼠單克隆抗體,北京博奧森生物技術(shù)公司;彩虹Marker,加拿大Fermentas公司。BCA Protein Assay Reagent Kit(Pierce)。其他試劑均為超級純。

1.1.3 實驗儀器:DYY-6c電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品;流式細胞儀(Beckman Coulter,BD);熒光倒置顯微鏡(Leica);Biorack 750液氮罐(Statebourne);TDL-4ZA低速離心機;GZX-9146MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);Multifuge 1L-R高速冷凍離心機(Thermo)。

1.2 實驗方法

1.2.1 篩選建立穩(wěn)定過表達和干擾STAT6細胞株

①感染目的細胞:感染前1天,胰酶消化HepG2細胞并計數(shù)細胞密度,按照2×105個/孔細胞密度接種至6孔板,加入DMEM完全培養(yǎng)液,置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng);培養(yǎng)24 h,融合度達到30%～50%后,在含有病毒的培養(yǎng)液中加入聚凝胺(polybrene,美國Sigma公司產(chǎn)品,工作液濃度為6μg/m L),促進病毒感染細胞;感染實驗分為4組:空白對照組(未經(jīng)處理的HepG2細胞)、陰性對照組(只感染pLVTHm空病毒)、感染 pLVTHm-STAT6-RNAi組、感染 pLVTHm-STAT6-ORF組;吸去細胞中的培養(yǎng)液后,加入含有10倍稀釋病毒量的完全培養(yǎng)液1mL/孔(稀釋倍數(shù)從103到107);第2天吸去細胞中含有病毒的培養(yǎng)液,加入2mL新鮮的完全培養(yǎng)液,繼續(xù)37℃、CO2體積分數(shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

② 篩選HepG2細胞:HepG2細胞分別在0、5、10、50和100 μg/mL鹽酸四環(huán)素(tetracycline,TET)情況下處理24 h后,采用CCK-8法測定細胞活性,以確定TET的半致死濃度;熒光顯微鏡下,通過載體報告子GFP檢測感染效率,然后以TET的半致死濃度處理感染效率為50%以上的HepG2細胞數(shù)次;篩選出STAT6-ORF以及STAT6-RNAi的穩(wěn)定表達HepG2細胞,并以1/2半致死量的TET維持培養(yǎng)。

③CCK-8檢測細胞活性:按試劑盒說明進行操作。

1.2.2 STAT6表達檢測

①RT-PCR檢測:細胞按1×106密度接種于六孔板培養(yǎng),經(jīng)處理后去上清,每孔加入1m L Trizol,靜置5min充分裂解(Trizol變粘稠)后吸到1.5 mL EP管中,或液氮速凍后-80℃保存?zhèn)溆?加Trizol1/5體積(200μL)的氯仿劇烈振蕩,室溫靜置5min,4℃,12 000 g離心15 min;將上清移到新EP管,加等體積(500 μL)異丙醇混勻,室溫靜置10min,4℃,12 000 g離心10min;棄上清,500μL 75%乙醇洗滌;4℃,12 000 g離心2min,重復(fù)1次;空甩一次(常溫12 000 g離心1min);超凈臺內(nèi)把柱子蓋打開吹1～2min,將柱子放到新的1.5mLEP管;加入10～40μLDEPC水(依材料多少而稀釋),62℃2min,常溫12 000 g離心1min,管內(nèi)即為RNA。取1μL分光光度計(eppendorf,AG)檢測純度和濃度,1μL進行瓊脂糖電泳檢測其完整性,余下部分立即保存于-80℃超低溫冰箱中,或立即用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)根據(jù)Primer Script TMRT-PCR試劑盒步驟進行操作。

用于RT-PCR反應(yīng)引物與條件如下:基因STAT6,檢測長度880 bp,反應(yīng)條件94℃,5 min;94℃,30 s,55℃,30 s,72℃,1 min,38 cycles;72℃,8min。基因GAPDH,檢測長度385 bp,反應(yīng)條件94℃,5 min;94℃,30 s,55℃,30 s,72℃,30 s,30 cycles;72℃,8min

② Western blot檢測

a.總蛋白提取:將各組細胞用胰酶消化,預(yù)冷PBS緩沖液沖洗3次,將細胞置于冰上,放置30min,加裂解液100μL充分裂解細胞。收集混合液至1.5 m LEP管中,12 000 g,4℃離心20 min。收集上清液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

b.蛋白定量:采用BCA Protein Assay Reagent Kit進行定量。將A液和B液(50∶1)混合,室溫放置30min后,取200 L混合液加入至96孔板中,然后加入不同濃度的BSA標準品及待測樣品10μL(1∶10稀釋),空白孔中加入雙蒸水10μL調(diào)零。37℃孵育30min后,多功能酶標儀測定在570 nm處的吸光度值(OD值),以標準品的OD值繪制成標準曲線,根據(jù)標準曲線計算蛋白濃度,以保證上樣量一致。

c.蛋白電泳:按分子生物學(xué)試驗指南制備分離膠和濃縮膠,經(jīng)BCA蛋白定量檢測后,待測蛋白的上樣濃度為100μg/mL。根據(jù)目的蛋白分子量的大小,選擇合適濃度的聚丙烯酞胺凝膠電泳。上層濃縮膠濃度為8%,下層分離膠濃度為3%。用上樣Buffer稀釋蛋白樣品,100℃水浴煮沸30 min,冰上放置2 min。每泳道上樣30μL蛋白樣品,80 V恒壓跑出濃縮膠,120 V恒壓至溴酚蘭剛好跑出分離膠。

d.G250染色判斷蛋白樣品質(zhì)量:卸去膠板,將凝膠置于G250染色液中,室溫染色2 h后,放入脫色液中脫色,并掃描電泳結(jié)果,從中選擇能跑出條帶完整清晰的樣品(如圖2),然后調(diào)整上樣量(保證蛋白上樣量一致)進行跑膠,轉(zhuǎn)膜等后續(xù)實驗。

e.半干式電轉(zhuǎn)印跡:蛋白電泳結(jié)束后,取出凝膠,在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡30min。按凝膠的大小比例剪好PVDF膜,置于甲醇中浸泡15min;同時按同樣大小比例裁剪干轉(zhuǎn)的厚濾紙,置于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸潤30min。按順利放置厚濾紙,PVDF膜,凝膠,厚濾紙至半干槽中,并用玻棒趕去每層的氣泡。蓋好金屬板,再加上陽極電極板進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)移條件:穩(wěn)壓8 V室溫轉(zhuǎn)27min(得到較多質(zhì)量＞72KD的蛋白),或8 V穩(wěn)壓17min(得到較多質(zhì)量＜72KD的蛋白),或者穩(wěn)壓8 V室溫轉(zhuǎn)23min。

f.免疫染色:取出轉(zhuǎn)移后的PVDF膜,用1×TBST潤濕后,置于5%脫脂奶粉,37℃封閉1 h;

用抗體buffer稀釋一抗(1∶500),置于雜交袋與PVDF膜進行一抗反應(yīng),4℃封閉過夜;取出PVDF膜,1×TBST洗滌,5 min,3次;PVDF膜與生物素化的二抗反應(yīng)(二抗用抗體buffer稀釋5 000倍),37℃雜交1.5 h;1×TBST洗滌PVDF膜,10min,2次;辣根過氧化物酶-ECL法進行檢測。

g.顯影定影:按照Pierce公司ECL發(fā)光檢測試劑盒說明書操作,將PVDF膜平鋪于保鮮膜上,吸取適量ECL顯色液滴加于膜上,吸去顯色液,迅速用保鮮膜將膜包好后置于暗匣內(nèi),暗房內(nèi)進行壓片,避光37℃反應(yīng)30min。膠片進行顯影和定影后,掃描記錄。

1.2.3 CCK-8法檢測HepG2細胞的增殖能力:實驗分為4組:空白對照組(未經(jīng)處理的 HepG2細胞)、陰性對照組(只感染pLVTHm空病毒)、感染 pLVTHm-STAT6-RNAi組、感染pLVTHm-STAT6-ORF組。將不同組HepG2細胞接種于96孔板(100μL/孔),置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄細胞的形態(tài)。分別于24、48、72和96 h后(細胞培養(yǎng)24 h左右進行傳代),加入10μL/孔的CCK-8溶液,操作時注意不要孔中生成氣泡,因為氣泡會折光影響OD值。

按CCK-8試劑盒說明書提供的方法檢測細胞增殖活性,將培養(yǎng)板置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育1.5 h,多功能酶標儀測定波長在450 nm處的吸光度值(OD值),以此反映細胞增殖活性。

1.2.4 Transwell實驗檢測HepG2細胞的遷移能力:實驗分為4組:空白對照組(未經(jīng)處理的HepG2細胞)、陰性對照組(只感染 pLVTHm空病毒)、感染 pLVTHm-STAT6-RNAi組、感染pLVTHm-STAT6-ORF組。在 Transwell上室的聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane,PC,直徑6.5 mm)上,加入稀釋后的Matrigel(3.9μg/μL)60～80μL,37℃反應(yīng)30min使 Matrigel聚合成凝膠。在Transwell下室中加入DMEM完全培養(yǎng)液600μL。用無血清培養(yǎng)液將待檢細胞制成單細胞懸液,每組細胞設(shè)3孔。在上室孔中準確加入細胞1×105個/孔,每孔100～200μL,置于37℃、CO2體積分數(shù)為5%飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0、24、48和72 h后。棄去上室液體,小心取出上室,用濕棉簽輕輕拭去膜上面未穿過膜的細胞。麗春紅染色30min,多余染液沖洗干凈后將膜雙側(cè)封固,80℃烤干。倒置顯微鏡(250倍)下直接計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 總RNA濃度和純度鑒定結(jié)果 各組細胞總RNA濃度和純度測定結(jié)果見表1。電泳結(jié)果見圖1。28s和18s條帶完整,可以進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

表1 各組細胞總RNA濃度和純度測定Tab.1 Each cell concentration and total RNA purity determination

圖1 各組總RNA電泳圖Fig.1 Total RNA electrophoresis results in each group

2.2 RT-PCR和Western Blot檢測STAT6的表達 RT-PCR結(jié)果顯示:STAT6-RNAi細胞中未檢測到 STAT6(見圖 2)。Western Blot結(jié)果顯示:STAT6-RNAi細胞中STAT6表達明顯下調(diào)(見圖3)。說明STAT6-RNAi轉(zhuǎn)染成功。

圖2 RT-PCR檢測慢病毒感染后HepG2細胞中STAT6的表達Fig.2 Rt-PCR reaults of STAT6 expression in HepG2 cells after infected with slow virus

圖3 Western Blot檢測慢病毒感染后HepG2細胞中STAT6的表達Fig.3 Western Blot results of STAT6 expression in HepG2 cells after infected with slow virus

2.3 CCK-8法檢測HepG2細胞增殖 光學(xué)顯微鏡下觀察細胞表型的改變,STAT6基因被干擾后,細胞逐漸崩解、漂浮死亡(見圖4);而過表達STAT6的HepG2細胞增殖加快,從第2代開始,細胞的增殖速度明顯提高。CCK-8檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染STAT6-RNAi的HepG2細胞活性從第2代開始下降,第3代和第4代均顯著低于第1代(F=102.984,P＜0.001,)。而過表達STAT6-ORF的HepG2細胞活性均顯著性升高(F=20.609,P＜0.001,見圖 5)。

圖4 STAT6-ORF和STAT6-RNAi對慢病毒感染HepG2細胞形態(tài)的影響Fig.5 Effects of STAT6-ORF and STAT6-RNAi on celluar morophology of HepG2 cell

圖5 STAT6-ORF和STAT6-RNAi對慢病毒感染HepG2細胞增殖活性的影響Fig.5 Effect of STAT6-ORF and STAT6-RNAion HepG2 cell proliferation after infected with slow virus

2.4 Transwell實驗檢測HepG2細胞的遷移能力 正常培養(yǎng)的HepG2細胞具有顯著的遷移能力;而STAT6-RNAi轉(zhuǎn)染后,細胞遷移能力顯著下降(F=136.660,P＜0.01);當(dāng)過表達STAT6-ORF后,細胞遷移能力顯著提高(F=576.219,P＜0.01,見圖6)。

圖6 STAT6-ORF和STAT6-RNAi對慢病毒感染HepG2細胞遷移的影響Fig.6 STAT6-ORF and STAT6-RNAieffects on HepG2 cellmigration slow virus infection

3 討論

近年來,STAT6信號通路越來越受到關(guān)注,研究表明,IL-4/STAT6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要影響。為了深入探討STAT6基因在肝癌細胞中的生物學(xué)功能,本研究對其進行RNA干擾和過表達實驗,構(gòu)建細胞模型,采用慢病毒三質(zhì)粒系統(tǒng)感染肝癌HepG2細胞,通過TET篩選出能夠穩(wěn)定干擾和過表達STAT6的HepG2細胞株,進行CCK-8細胞活性實驗,檢測分別下調(diào)和上調(diào)STAT6的表達對HepG2細胞的增殖影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),STAT6被干擾后,細胞增殖減慢,隨著培養(yǎng)時間延長及傳代,與感染第1代(病毒感染細胞0 h的細胞活性)比較,細胞活性從第2代開始下降,第3代和第4代均顯著低于第1代(F=102.984,P＜0.001),當(dāng)HepG2細胞傳至第3代時,絕大部分細胞已經(jīng)死亡,細胞逐漸崩解、漂浮死亡;而過表達STAT6的HepG2細胞增殖加快,從第2代開始,細胞的增殖速度明顯提高,細胞活性均顯著性升高(F=20.609,P＜0.001)。實驗表明,STAT6的表達異常影響肝癌細胞的增殖能力。同時,結(jié)果表明,正常培養(yǎng)的HepG2細胞具有較強的遷移能力;而干擾STAT6表達后,穿過Transwell上室PC膜的細胞數(shù)量明顯減少,細胞的遷移能力顯著性下降(F=136.660,P＜0.01);當(dāng)過表達STAT6后,細胞的遷移能力顯著提高(F=576.219,P＜0.01),表明STAT6表達對肝癌細胞的遷移能力有重要影響。綜上所述,本文通過干擾和過表達STAT6,證實了該基因在肝癌細胞中的生物學(xué)功能,直接影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究中構(gòu)建的STAT6-RNAi和STAT6-ORF穩(wěn)定株,方便于后期建立動物模型,進行裸鼠成瘤實驗,體內(nèi)驗證STAT6的生物學(xué)功能,證實該基因的臨床意義。在此基礎(chǔ)上,便于進一步研究STAT6促進肝癌細胞增殖及遷移的分子機制。

［1］ Schindler C，Darnell JE Jr.Transcriptional responses to polypeptide ligands:the JAK-STAT pathway［J］.Annu Rev Biochem，1995，64（5):621-651.

［2］ Hebenstreit D，Wirnsberger G，H orejs-Hoeck J， et al.Signaling mechanisms，interaction partners， and target genes of STAT 6 ［ J］.Cytokine Growth Factor Rev，2006，17（3):173-188.

［3］ Yum iko K，Hyun JL，James AJ，et al.A conditionally active form of STAT6 canmimic certain effectsof IL-4［J］.Immunol，1998，161（4):1074-1077.

［4］ Bowman T，Garcia R，Turkson J，et al.STATs in on cogenesis［J］.Oncogene，2000，19（21):2474-24881.

［5］ Huang H，PaulWE.Protein tyrosine phosphatase activity is required for IL-4 induction of IL-4 receptor A-chain ［ J］.J Immunol，2000，164（3):1211-1215.

［6］ 盛青，何建猷，梁標.STAT6與支氣管哮喘1國外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊，2004，24（1):12-141.

［7］ Imada K，Leonard WJ.The Jak-STAT pathway［J］.Mol Immunol，2000，37（7):1-11.

［8］ Leonard W J.Role of Jak kinases and STATs in cytokine signal transduction［J］.Int JH ematol，2001，73（12):271-277.

［9］ Levings MK，Schrader JW.IL-4 inhibits the production of TNF-alpha and IL-12 by STAT6-dependen t and independentmechanisms［J］.J Immunol，1999，162（14):5224.

［10］ ZhangWJ，Walter AK，Jennifer L， et al.Human B lymphoblast cell lines defective of Stat6 signaling produce high levels of proo inflammatory cytokines IL-12，TNF-A and IFN-C［J］.Int JOncology，2004，24（11):447-453.

［11］ 鄧繼先，沈偉.用慢病毒載體制備轉(zhuǎn)基因動物的研究進展［J］.中國生物工程雜志，2004，24（9):16-19.

［12］ Zhang B，Liu XX，He JR，et al.Pathologically decreased miR-26a antagonizes apoptosis and facilitates carcinogenesis by targeting MTDH and EZH2 in breast cancer［J］.Carcinogenesis，2011，32（1):2-9.

［13］ 湯海濤，安春麗.慢病毒載體的構(gòu)建及其在基因治療方面的應(yīng)用［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，2009，5（2):142-144.

［14］ Booz GW，Day JN，Baker KM.Interplay between the cardiacren in angiotens in system and JAK-STAT signaling:role in cardiac hypertrophy，ischemia/reperfusion dysfunction， and heart failure［J］.JMol Cell Cardio，2002，34（11):1443-1453.

［15］ Bolli R，Dawn B， Xuan YT.Role of the JAK-STAT pathway in protection againstmyocardial ischemia/reperfusion in jury［J］.Trends Card iovasc Med，2003，13（2):72-79.

［16］ L in Q，Lai R，C h irieac LR，et al.Constitutive activation of JAK3/STAT3 in colon carcinom atumors and cell lines:inhibition of JAK3/STAT3 signaling induces apoptos is and cell cycle arrest of colon carcinom a cells［J］.Am JPatho，2005，167（4):969-980.

(編校:吳茜)

Construction of stably transfected STATb-RNAi in HepG2 and identification of its function

ZHANG Yu-shan1,GAO Guo-sheng2

(1.Department of Infection,Nanyang Central Hospital,Nanyang 473000,China;2.Departmen of Liver Infectious,Ningbo Disease hospital,Ningbo 315000,China)

Objective To explore the effect of RNAi lentivirus vector on stability HepG2 cell proliferation,migration.Methods The virus infected the HepG2 cells stablywere divided into four groups:controlgroup(untreatment),negative controlgroup(infected with PLV-control vector),pLVTHm-STAT6-RNAi group,and pLVTHm-STAT6-ORF goup.Expressing STAT6-ORF and STAT6-RNAi cell lines stably were obtained,and the STAT6 expression were detected by PCR and Western blot.CCK-8 assay and Transwell assay were used to detect the stably transfected cell lines activity and cell migration ability changes.Results The STAT6-ORF and STAT6-RNAi HepG2 stable expression cell line were obtained successfully by TET screening.Compared with control cells,cell proliferation in STAT6-ORF overexpression group were fast(F=4.279,P=0.021),and had high mobility;and in STAT6-RNAi group,the cell proliferated slowly,with the culture time prolonged and passage to the cells of the third generation(HepG2 most cells have died),the cells gradually disintegrated,floating die,cell activity decreased significantly(F=290.114,P＜0.001),transfer capacity decreased significantly.Conclusion The STAT6-ORF and STAT6-RNAi HepG2 stable expression cell line were obtained successfully,is convenient to establish the animalmodel of late,tumor formation in nudemice,biological functions in vivo validation of STAT6,confirme the clinical significance of the gene.

lentiviral package;STAT6 RNA;interference transfection;HepG2 cells

R36.1

A

1005-1678（2014)06-0051-05

2011年浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生計劃(2011KYB107)

張玉山，本科，副主任醫(yī)師，研究方向：感染性疾病及肝臟病的臨床研究，E-mail： zhang66286@163.com。