CD137L在非小細(xì)胞肺癌增殖、遷移、侵襲中的作用及機(jī)制

鄭芳霞,李學(xué)章,鄭衛(wèi)霞,程玉峰Δ,盛延興,高雯

(1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 放療科,山東 濟(jì)南 250012;2.山東省聊城市人民醫(yī)院 放療科,山東 聊城 252000;3.南京醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系,江蘇 南京 210029)

CD137L在非小細(xì)胞肺癌增殖、遷移、侵襲中的作用及機(jī)制

鄭芳霞1,李學(xué)章2,鄭衛(wèi)霞2,程玉峰1Δ,盛延興2,高雯3

(1.山東大學(xué)齊魯醫(yī)院 放療科,山東 濟(jì)南 250012;2.山東省聊城市人民醫(yī)院 放療科,山東 聊城 252000;3.南京醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)系,江蘇 南京 210029)

目的 研究CD137L在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)，及其對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，探討其可能的分子生物學(xué)機(jī)制。方法 通過(guò)體外構(gòu)建CD137L高表達(dá)慢病毒載體［A549-TC-1（+)］及CD137L-RNA干涉慢病毒載體［A549-TC-1（-)］和空白載體（A549-control)，分別轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞。采用Western blot檢測(cè)3組細(xì)胞CD137L蛋白的表達(dá)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況；Matrigel transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)研究肺癌細(xì)胞侵襲能力；ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞上清IL-6和IL-8的水平。結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示:與A549細(xì)胞相比，CD137L蛋白在A549-TC-1（+)細(xì)胞中表達(dá)明顯增多，A549-TC-1（-)細(xì)胞中表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)，在轉(zhuǎn)染A549-control中無(wú)明顯變化，表明3種病毒載體可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及Matrigel Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與A549-control相比，A549-TC-1（+)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯增強(qiáng)，A549-TC-1（-)細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯減弱，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示:A549-TC-1（+)細(xì)胞中細(xì)胞因子 IL-6、IL-8的水平明顯高于A549-TC-1（-)細(xì)胞組和正常A549細(xì)胞組。結(jié)論 CD137L對(duì)非小細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、侵襲具有正性調(diào)節(jié)功能，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)IL-6、IL-8的分泌進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤的生長(zhǎng)、增殖和侵襲能力有關(guān)。

CD137L；非小細(xì)胞癌；增殖；遷移；侵襲

非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要類型,未發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺癌患者其5年生存率達(dá)50%,而局部浸潤(rùn)或區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者只有約20%,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者其5年生存率僅為4%,可見(jiàn)侵襲和轉(zhuǎn)移是造成非小細(xì)胞肺癌患者療效差和死亡的主要原因［1-2］。CD137L及其受體CD137是一對(duì)重要的共刺激分子,在抗腫瘤免疫中起著重要的作用。主要表達(dá)于活化的T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞,參與T細(xì)胞的活化,細(xì)胞因子的分泌以及調(diào)控單核細(xì)胞的增殖和分化等［3-4］。近年發(fā)現(xiàn)CD137L在多種腫瘤細(xì)胞株及人體腫瘤組織細(xì)胞有組成型表達(dá),并對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生一定影響［5-6］。為進(jìn)一步明確CD137L對(duì)非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)行為影響的具體機(jī)制,本研究旨在通過(guò)體外構(gòu)建CD137L高表達(dá)慢病毒載體及CD137L-RNA干涉慢病毒載體轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞,探討CD137L對(duì)非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制,為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞源自中國(guó)腫瘤細(xì)胞庫(kù);CD137L高表達(dá)慢病毒、CD137L-siRNA慢病毒、空白載體慢病毒由上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司構(gòu)建。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。兔抗人CD137L抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;兔抗人β-actin抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;麗春紅S購(gòu)自德國(guó)Serva公司;考馬斯亮藍(lán)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;新生牛血清購(gòu)自中國(guó)四季青公司;RPMI 1640購(gòu)自美國(guó) Gibco公司;IL-6、IL-8酶聯(lián)吸附檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自上海綠葉生物技術(shù)有限公司。玻片架購(gòu)自北京華越生物科技有限公司;染色缸購(gòu)自北京華越生物科技有限公司;恒溫烤箱購(gòu)自吳江遠(yuǎn)順烘箱設(shè)備有限公司;孵育盒購(gòu)自北京華越生物科技有限公司;倒置光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):A549細(xì)胞用含10%新生血清及雙抗(青霉素、鏈霉素各100 U/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)貼壁培養(yǎng),置于5%CO2、37℃、濕度為95%培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。選擇第三代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞,計(jì)數(shù)按2×103每孔接種于無(wú)菌24孔培養(yǎng)板中,繼續(xù)培養(yǎng)12 h,用于后期實(shí)驗(yàn)。選取24孔板中1孔細(xì)胞計(jì)數(shù),估算每孔中 A549細(xì)胞數(shù)量,根據(jù)細(xì)胞感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)=50分別在含10%FBS及雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中添加制備的3種病毒,置于5%CO2、37℃培養(yǎng)12 h。用無(wú)菌PBS震蕩清洗細(xì)胞3min×3次,換用常規(guī)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用有限稀釋法篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞,將轉(zhuǎn)染CD137L高表達(dá)病毒、CD137L-siRNA慢病毒及空白載體慢病毒的細(xì)胞分別命名為A549-CD137L(+)、A549-CD137L(-)、A549-control。

1.2.2 Western blot檢測(cè)細(xì)胞CD137L蛋白表達(dá):選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549-CD137L(+),A549-CD137L(-),A549-control及對(duì)照組細(xì)胞,PBS洗滌3遍,細(xì)胞計(jì)數(shù)并離心,每1×107個(gè)細(xì)胞加入150μL RIPA Buffer,4℃裂解60 min,4℃離心20min,收集上清。利用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。用SDS凝膠電泳將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h;TBST反復(fù)洗膜3次,每次5 min。加入一抗(CD137L,1∶500;β-actin,1∶2 000,TBST稀釋)浸透PVDF膜,4℃過(guò)夜,次日復(fù)溫1 h;TBST洗膜3次,加入二抗(羊抗兔 IgG-HRP,1:5000,TBST稀釋),室溫孵育2 h,TBST洗膜3次;利用低背景化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒成像系統(tǒng)采集圖像。以β-actin內(nèi)參照條帶作為參照,分析目的條帶的代表的蛋白表達(dá)水平［7］。

1.2.3 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549-CD137L(+),A549-CD137L(-),A549-control細(xì)胞,計(jì)數(shù)后各取1×107個(gè)細(xì)胞,按照4×103個(gè)細(xì)胞/孔轉(zhuǎn)至無(wú)菌96孔板,每種細(xì)胞鋪8孔,共鋪8個(gè)96孔板,置入5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。鋪板后24 h取出一塊板,吸出原培養(yǎng)液后加入含F(xiàn)BS及雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液100μL及濃度為5 mg/m L的MTT溶液20μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h,隨后終止培養(yǎng),吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入150μL DMSO,振蕩10min,在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值,波長(zhǎng)492,記錄結(jié)果。每24 h重復(fù)上述步驟1次,直至第8天。以時(shí)間為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Matrigel Transwell小室細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel 40μL均勻鋪在Transwell小室內(nèi),靜置30min。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549-CD137L(+),A549-CD137L(-),A549-control細(xì)胞各2×105個(gè),加入150μL無(wú)血清含雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中,置入Transwell小室內(nèi)。Transwell小室置于24孔板內(nèi),板內(nèi)加入600μL含15%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液,并置于37℃恒溫孵育箱培養(yǎng)。48 h后擦除小室內(nèi)部Matrigel膠及膠上未遷出細(xì)胞,PBS液洗3min×3次,4%多聚甲醛固定0.5 h,常規(guī)HE染色。隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野(200×)計(jì)數(shù)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 IL-6、IL-8水平檢測(cè):將 A549-CD137L(+),A549-CD137L(-),A549-control3組細(xì)胞,在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d,收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清液,固定到硝酸纖維素膜中;具體步驟按照ELISA酶聯(lián)吸附檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)IL-6、IL-8的水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,正態(tài)計(jì)量資料采用“±s”表示,組間比較采用t檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測(cè)細(xì)胞CD137L白表達(dá) Western blot結(jié)果顯示:與A549細(xì)胞中CD137L蛋白表達(dá)量相比,A549-TC-1(+)細(xì)胞CD137L蛋白表達(dá)明顯增多,A549-TC-1(-)細(xì)胞明顯減少,A549-control無(wú)明顯變化差別(見(jiàn)圖1)。表明3種載體構(gòu)建成功,能用于下游實(shí)驗(yàn)。

圖1 4組細(xì)胞CD137L蛋白表達(dá)比較1.A549-CD137L(+);2.A549-CD137L(-);3.A549;4.A549-control#P＜0.05,與3(A549組)比較Fig.1 CD137L-protein expression in four groups1.A549-CD137L(+);2.A549-CD137L(-);3.A549;4.A549-control#P＜0.05,compared with A549 group

2.2 CD137L對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示:A549-CD137L(+)細(xì)胞增殖最快,A549-CD137L(-)最慢;3組細(xì)胞數(shù)在第三天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),第4天出現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。表明 CD137L基因的表達(dá)對(duì)肺癌A549細(xì)胞的增殖能力有正調(diào)節(jié)效應(yīng)(見(jiàn)圖2)。

圖2 3組細(xì)胞增殖能力比較#P＜0.05,##P＜0.01,與A549-control組比較Fig.2 Comparison of cell proliferation in three A549 cells#P＜0.05,##P＜0.01,compared with A549-control group

2.3 CD137L對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的影響 利用Transwell小室模擬血管基底膜的人工基底膜Matrigel膠,通過(guò)計(jì)數(shù)穿過(guò)Matrigel膠及Transwell小室膜的A549細(xì)胞數(shù)量來(lái)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的體外侵襲能力。結(jié)果顯示:與A549-control相比,A549-CD137L(+)細(xì)胞穿膜數(shù)量明顯增加,而A549-CD137L(-)細(xì)胞穿膜數(shù)量明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示CD137L對(duì)肺癌A549細(xì)胞的侵襲能力有正調(diào)節(jié)作用(見(jiàn)圖3)。

圖3 3組細(xì)胞侵襲能力比較#P＜0.05,與A549-control組比較Fig.3 Comparison ofmigration ability in three groups#P＜0.05,compared with A549-control group

2.4 CD137L對(duì)A549細(xì)胞IL-6、IL-8水平的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與A549-control組細(xì)胞中細(xì)胞因子IL-6、IL-8的分泌水平相比,A549-CD137L(+)細(xì)胞中的IL-6、IL-8分泌量明顯升高,A549-CD137L(-)細(xì)胞中IL-6、IL-8分泌量明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。表明CD137L的高表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞因子IL-6、IL-8的分泌量(見(jiàn)表1)。

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移與很多因素有關(guān),包括腫瘤在原發(fā)部位的生長(zhǎng),腫瘤離開(kāi)原發(fā)灶進(jìn)入脈管系統(tǒng),腫瘤到達(dá)遠(yuǎn)隔臟器并繼續(xù)生長(zhǎng)。其中腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲是其生物學(xué)行為的關(guān)鍵步驟。肺癌的局部增殖不僅表現(xiàn)為原發(fā)腫瘤的體積增大,更是原發(fā)腫瘤浸潤(rùn)脈管系統(tǒng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)因素,而轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致肺癌病人死亡的主要原因,也是肺癌治療的難點(diǎn)［8-9］。因此,打破腫瘤患者的免疫耐受,激活體內(nèi)的免疫功能是當(dāng)前肺癌免疫治療的主要方向。CD137L作用于CD137后可以通過(guò)TRAF2、TRAF1和MAPK等途徑傳遞細(xì)胞內(nèi)信號(hào),調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放,影響生物學(xué)行為［10］。已經(jīng)證實(shí)CD137L在實(shí)體瘤上有表達(dá),主要在NSCLC細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì),以及部分細(xì)胞核內(nèi)表達(dá),然而在非轉(zhuǎn)換的細(xì)胞中無(wú)表達(dá),推測(cè)腫瘤細(xì)胞表達(dá)CD137L可能誘導(dǎo)保護(hù)性抗腫瘤免疫的產(chǎn)生［11］。研究發(fā)現(xiàn)CD137 L在人NSCLC的表達(dá)與患者年齡、性別和病理類型等無(wú)明顯的相關(guān)性,但與患者病理分期以及預(yù)后有一定的聯(lián)系;且CD137L陽(yáng)性表達(dá)的患者生存期較CD137L陰性表達(dá)的患者延長(zhǎng),說(shuō)明高表達(dá)CD137L能延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間,為NSCLC免疫治療提供依據(jù)［5］。研究證實(shí)CD137L在多種腫瘤細(xì)胞株及腫瘤組織上可組成性表達(dá),CD137和CD137L的相互作用可以促進(jìn)細(xì)胞株的增殖、延長(zhǎng)其生存、并降低抗腫瘤藥物的效應(yīng)［12］。另外,CD137L通過(guò)與表達(dá)在T細(xì)胞表面的CD137交聯(lián)可以促進(jìn)T細(xì)胞的活化、增殖,增加細(xì)胞因子的分泌及活化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(AICD)的抑制,同時(shí)也介導(dǎo)反向共刺激信號(hào),因此T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞通過(guò)CD137/CD137L雙向作用而相互活化,介導(dǎo)雙向信號(hào)傳導(dǎo),促進(jìn)免疫反應(yīng),可以運(yùn)用于人類的腫瘤免疫治療［13-14］。

IL-6是一種多功能蛋白,主要為單核-巨噬細(xì)胞和活化的T細(xì)胞。它不僅作用于多種免疫活性細(xì)胞,造血細(xì)胞,參與機(jī)體的炎癥反應(yīng),還可以作為自分泌生長(zhǎng)因子發(fā)揮雙向性調(diào)節(jié)作用,調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng),從而加強(qiáng)或抑制腫瘤的生長(zhǎng)。IL-8是趨化因子超家族中的一員,具有激活和趨化嗜中性粒細(xì)胞,參與機(jī)體炎癥反應(yīng)。同時(shí)也是腫瘤血管的形成因子,促進(jìn)腫瘤新生血管形成,并可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的移動(dòng),刺激某些腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并使細(xì)胞表達(dá)黏附分子等,在腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

本文通過(guò)體外建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)和低表達(dá)CD137L的肺癌A549細(xì)胞系,用單一因素影響肺癌細(xì)胞,研究CD137L基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞生物學(xué)能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:CD137L對(duì)于肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力具有正性調(diào)節(jié)功能,具體表現(xiàn)為CD137L表達(dá)增高的A549細(xì)胞其增殖、遷移及侵襲能力增強(qiáng),而CD137L表達(dá)降低的A549細(xì)胞其增殖、遷移及侵襲能力減弱。說(shuō)明CD137L基因的表達(dá)增高能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移,并對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲能力有正調(diào)節(jié)效力。各組細(xì)胞中IL-6、IL-8的水平結(jié)果顯示:CD137L高表達(dá)的細(xì)胞中IL-6、IL-8分泌量明顯高于CD137L低表達(dá)和正常組,說(shuō)明CD137L能通過(guò)增加細(xì)胞因子IL-6的分泌,作用于腫瘤細(xì)胞,促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng);增加自分泌因子IL-8的水平,促進(jìn)腫瘤血管形成,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖,影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

CD137L分子被認(rèn)為是T細(xì)胞的共刺激分子,CD137/CD137L信號(hào)引起的生物學(xué)效應(yīng)十分復(fù)雜,這種復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)得到初步研究。CD137配體受體之間的雙向信號(hào)使許多免疫細(xì)胞與免疫細(xì)胞、免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞之間產(chǎn)生交聯(lián),并將這種細(xì)胞之間產(chǎn)生的交聯(lián)作用及時(shí)反饋,使調(diào)節(jié)機(jī)體作用更加精確［15］。CD137L作為共刺激分子,因其逆向信號(hào)的存在,使CD137L的作用不單是提供第二信號(hào)引起T細(xì)胞活化的功能。表明CD137L參與腫瘤的發(fā)展,通過(guò)與 CD137交聯(lián)向表達(dá)CD137L的腫瘤細(xì)胞傳遞逆向信號(hào),產(chǎn)生的效應(yīng)可以是增強(qiáng)免疫,也可以使機(jī)體腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視,影響機(jī)體免疫功能。CD137L對(duì)于腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲具體的作用機(jī)制以及相關(guān)的信號(hào)通路都還有待進(jìn)一步研究,以期為腫瘤免疫治療提供新的思路。

［1］ Geiger TR，Peeper DS.Metastasis mechanisms［J］.Biochim Biophys Acta，2009，17（4):293-308.

［2］ 孟逸萍.環(huán)氧化酶-2在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后關(guān)系的Meta分析［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2012，33（6):906-908.

［3］ Zhao S，Herbert S.CD137L ligand， a member of the tumor necrosis factor family，regulates immune responses via reverse signal transduction［J］.JLeuko Biol，2011，89（1):21-29.

［4］ Kwajah MMS，Mustafa N，Holme AL，et al.Biphasic activity of CD137 ligand-stimulated monocytes on T cell apoptosis and proliferation［J］.J Leuko Biol，2011，89（5):707-720.

［5］ 承婷，劉怡茜，武常玲，等.非小細(xì)胞肺癌組織CD137L其臨床意義［J］.中華腫瘤防治雜志，2012，19（7):506-509.

［6］ Wang Q，Zhang P，Zhang Q，et al.Analysis of CD137 and CD137L Expression in Human Primary Tumor Tissues［J］.Croat Med J，2008，49（2):192-200.

［7］ Gullo C，Koh LK，Pang WL，et al.Inhibition of proliferation and induction of apoptosis inmultiplemyeloma cell lines by CD137L ligand signaling［J］.PLos One，2010，5（5):10845-10849.

［8］ 承婷.CD137L在非小細(xì)胞肺癌上的表達(dá)及其臨床意義［D］.南京醫(yī)科大學(xué)，2011.

［9］ Scandiuzzi L，Ghosh K，Zang X.T cell costimulation and coinhibition:geneticsand disease［J］.Discov Med，2011，12（63):119-128.

［10］ Fernández Do Porto， Jurado DA， Pasquinelli JO， et al.CD137 differentially regulates innate and adaptive immunity against Mycobacterium tuberculosis［J］.Immunol Cell Biol， 2011，90（7):449-456.

［11］ 牟永告，謝海濤，彭輝，等.4-1BBL分子在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義［J］.中國(guó)病理生理雜志，2010，26（12):2342-2346.

［12］ 武常玲，承婷，劉怡茜.CD137L在肺癌細(xì)胞株的表達(dá)及其生物學(xué)功能［J］.江蘇醫(yī)藥，2012，38（11):1241-1244.

［13］ S llner L，Shaqireen DO Kwajah MM，Wu JT，et al.Signal transduction mechanisms of CD137 ligand in human monocytes［J］.Cell Signal，2009，19（9):1899-1908.

［14］ Julia María Martínez Gómez，Vanessa Hui Qi Koh，Benedict Yan，et al.Role of the CD137 ligand（CD137L)signaling pathway during Mycobacterium tuberculosis infection［J］.Immunobiology，2013，12（7):1-9.

［15］ Baessler T，Charton JE，Schmiedel BJ，et al.CD137 ligand mediates opposite effects in human and mouse NK cells and impairs NK cell reactivity against human acute myeloid leukemia cells［J］.Blood，2010，115（15):3058-3069.

(編校:吳茜)

The role and mechanism of CD137L in non-small cell lung cancer proliferation,m igration and invasion

ZHENG Fang-xia1,LIXue-zhang2,ZHENGWei-xia2,CHENG Yu-feng1Δ,SHENG Yan-xing2,GAOWen3

(1.Department of Radiation Oncology,Qilu Hospital of Shandong University,Jinan 250012,China;2.Department of Radiation Oncology,Liaocheng People's Hospital,Liaocheng 252000,China;3.Department of Clinical Medicine,Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China)

Objective To study CD137L expression in non-small cell lung cancer,its effect on cell proliferation,migration and invasion and explore the molecular mechanisms of non-small cell lung cancer invasion and metastasis.Methods Lentiviral vectors of CD137L overexpression,CD137L-RNA interference and A549 controlwere constructed and transfected into A549 cell.CD137L protein expression in three groupswere detected by Western blot;cell proliferation assay were conducted by MTT;cancer cells proliferation,invasiveness were measured by Matrigel transwell chamber invasion assay;IL-6 and IL-8 levels in cell supernatants were detected by ELISA method.Results Western blot results showed that:compared with A549 cell,CD137L protein expression in A549-TC-1(+)cell increased significantly,A549-TC-1(-)cell decreased significantly,the differences were all statistically significant(P＜0.05),and therewas little change in transfected A549-control cell,which indicating that three kinds of viral vectors can be used for subsequent experiments..MTT and matrigel transwell chamber invasion assay results showed that:compared with A549-control cell,A549-TC-1(+)cell proliferation migration and invasion capacitywere enhanced,and A549-TC-1(+)cellwereweakened,the differenceswere all statistically significant(P＜0.05).ELISA results showed that cell serum IL-6,IL-8 levels in A549-TC-1(+)cell were all significantly higher than A549-TC-1(-)cell and normal A549 cell a groups.Conclusion CD137L can regulate non-small cancer cell proliferation and invasion positivily,the mechanism may related to increasing IL-6,IL-8 secretion and thereby enhancing tumor growth,proliferation and invasion.

CD137L;non-small cell lung cancer;proliferation;migration;invasion

R734

A

1005-1678（2014)06-0014-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(81101759)

鄭芳霞，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤放療、化療及基礎(chǔ)研究，E-mail：15006396314@163.com；程立峰，通信作者，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤的放療、化療，E-mail：qlcyf@126.com。