傳統(tǒng)中藥質(zhì)量控制生物活性標(biāo)志物的篩選方法綜述

張慧仙

摘要：傳統(tǒng)中藥（TCMs）具有特有的理論基礎(chǔ)和悠久歷史的臨床實(shí)踐，使其在全世界獲得了越來(lái)越多的關(guān)注。但是中藥質(zhì)量的不可控性成為限制其現(xiàn)代化和全球化發(fā)展的瓶頸。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)中藥質(zhì)量控制研究的深入，一些新興的分析方法被發(fā)現(xiàn)和運(yùn)用。該文綜述了中藥中通過(guò)生物色譜法篩選生物活性標(biāo)志物的策略來(lái)研究其質(zhì)量控制的方法，這些方法具有高靈敏、定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，對(duì)中藥精準(zhǔn)的質(zhì)量控制具有重要意義。

關(guān)鍵詞：中藥；質(zhì)量控制；生物活性標(biāo)志物；篩選方法

中圖分類號(hào) R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1007-7731（2014）13-19-02

1 前言

在中國(guó)，中藥用來(lái)預(yù)防和治療人類疾病已有數(shù)千年的歷史。由于中藥悠久歷史的臨床應(yīng)用和可靠的治療功效，其吸引了全球的關(guān)注，許多大的制藥公司都將中藥作為一個(gè)好的儲(chǔ)存庫(kù)來(lái)發(fā)現(xiàn)具有天然生物活性的化合物。然而，中藥具有復(fù)雜的化學(xué)成分，倘若在研究時(shí)只強(qiáng)調(diào)少數(shù)的化學(xué)成分，那么其整體性將被忽略［1］。

在中藥現(xiàn)代化和全球化的過(guò)程中，中藥的關(guān)鍵問題是其質(zhì)量的穩(wěn)定性和可控性。一般地，中藥的識(shí)別是通過(guò)其形態(tài)、TLC鑒別或者含量測(cè)定的幾個(gè)標(biāo)志物。然而，這些方法不能提供藥物的所有性質(zhì)，不能用來(lái)區(qū)分具有相似形態(tài)或者相似化學(xué)組成的中藥，如無(wú)法用齊墩果酸來(lái)識(shí)別女貞子、牛膝或威靈仙的根。由于中藥具有多靶點(diǎn)和協(xié)同作用的特性，所以有必要在天然藥物中找到一種用來(lái)反映大多數(shù)成分變化的綜合方法，尤其是與藥理作用和臨床療效有關(guān)的變化。因此，近幾年來(lái)，中藥分析已經(jīng)開始著重于分析中藥的整體性和綜合性。許多綜合方法如指紋圖譜—包括色譜法和光譜法、多組分分析法，已經(jīng)用于中藥質(zhì)量控制；一些基于研究藥物的吸收、分布、代謝和消除性能的生物色譜法也已經(jīng)用于中藥分析和生物活性標(biāo)志物的篩選；同時(shí)還引入一些其他系統(tǒng)生物學(xué)方法（包括基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)）來(lái)更清晰、科學(xué)地研究中藥。

2 通過(guò)生物色譜法對(duì)生物活性標(biāo)志物的篩選

目前，中草藥質(zhì)量控制的方法是化合物定位或全局定位，前者針對(duì)的是已知分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)的特定成分，而后者針對(duì)的是所有可檢測(cè)的成分。在化合物定位實(shí)驗(yàn)中，選擇一個(gè)與療效有關(guān)的化學(xué)標(biāo)志物是非常重要的。但是由于中草藥中具有治療性或活性的成分還沒有被全部闡明，這些成分常被一些不具有特征性但是易獲得的組分選擇性替代，因此這些不恰當(dāng)?shù)臉?biāo)志物不能確保中藥有效的質(zhì)量控制。因此，中藥生物活性成分的篩選不僅對(duì)闡明治療物質(zhì)基礎(chǔ)和發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物有積極意義，而且對(duì)質(zhì)量控制提供適合的化學(xué)標(biāo)志物也有重要的作用。

傳統(tǒng)的具有生物活性化學(xué)標(biāo)志物的篩選方法是首先對(duì)化合物進(jìn)行分離，然后運(yùn)用動(dòng)物模型、器官或組織模型、細(xì)胞模型或者酶和受體模型對(duì)其進(jìn)行體內(nèi)或者體外生物活性的篩選。然而，這些模型后來(lái)被證明既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，同時(shí)也不能恰當(dāng)?shù)仃U明中藥的協(xié)同作用。因此，人們將一些新的綜合方法用于中藥潛在活性成分的篩選和預(yù)測(cè)。一般來(lái)說(shuō)，生化色譜法在生物活性物質(zhì)篩選和分析方面有3個(gè)策略：第一，將某些生物分子固定在色譜柱上，來(lái)反映被分析物和色譜柱上靶點(diǎn)之間的親和作用；第二，運(yùn)用色譜指紋圖譜分析中藥與某些目標(biāo)的生物大分子（DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、酶等）的相互作用；第三，通過(guò)體內(nèi)或體外的方式研究中藥的代謝，然后分析代謝指紋圖譜。

2.1 固定化親和色譜法 親和色譜法是根據(jù)生物活性化合物與固定化的靶標(biāo)大分子（蛋白質(zhì)、酶、抗體、脂質(zhì)體、DNA等）之間的生物交互作用，該方法已被成功地應(yīng)用到快速探測(cè)藥物靶標(biāo)結(jié)合，并研究蛋白質(zhì)-配體結(jié)合的相互作用。這包括了固定化DNA層析、固定化血漿蛋白層析、固定化脂質(zhì)體色譜（ILC）和固定化生物膜色譜（IBMC）。

DNA是用于篩選具有治療性和毒性的潛在候選藥物的重要指標(biāo)之一。血漿蛋白在藥物分布的過(guò)程中具有重要的作用，因此2個(gè)主要的血漿蛋白、人血清白蛋白（HSA）和α1-酸性糖蛋白（AGP）通常用于候選藥物的篩選。與前2種方法不同，ILC與IBMC對(duì)于體外研究藥物-生物膜相互作用來(lái)說(shuō)是好的模型，它可以通過(guò)生物膜探測(cè)藥物的滲透能力。運(yùn)用這些方法，可以對(duì)很多中藥材或它們配伍的處方進(jìn)行了研究，包括川芎、黃連、大黃、當(dāng)歸、龍膽瀉肝湯（LXD）及當(dāng)歸補(bǔ)血湯（DBD）等［2-3］。

雖然這些方法已被批準(zhǔn)用于從中藥中快速篩選和分析生物活性候選物的方法，但是應(yīng)注意到其有一定的局限性。如只有一種類型的靶點(diǎn)被固定在固定相上（例如只有HAS），那么與其它靶點(diǎn)結(jié)合的活性化合物可能會(huì)丟失；固定化靶點(diǎn)的壽命是非常短的，并且所分析的物質(zhì)和所用的凝膠基質(zhì)必須適應(yīng)于包封或固定化過(guò)程；親和色譜法的分離能力要低于傳統(tǒng)的HPLC法，以至于幾個(gè)化合物可能被共洗脫出來(lái)成為一個(gè)峰，并且由于流動(dòng)相的限制，這種方法不能直接和MS聯(lián)用，導(dǎo)致保留組分聯(lián)機(jī)識(shí)別具有一定的難度。

2.2 生物指紋圖譜分析法 為了克服通過(guò)親和色譜法篩選方法時(shí)存在的問題，鄒和李課題組提出中藥的多生物活性化合物篩選和分析的一些方法，這些方法是基于中藥提取物與生物系統(tǒng)（DNA、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等）相互作用前后指紋圖譜的變化［4-5］。HPLC和HPLC-MS是常用的分析方法，根據(jù)不同的取樣方法，這些生物指紋圖譜分析被分為3種類型，即微透析提取法、平衡透析提取法和細(xì)胞或靶分子提取法。

微透析和平衡透析的機(jī)制非常相似，因?yàn)樗鼈兌际褂昧税胪改ぴ韥?lái)區(qū)分中藥中與靶分子已結(jié)合的成分和未結(jié)合的成分［4］。平衡透析中，脂質(zhì)體平衡透析（LED）是一種成熟的技術(shù)用于中藥中交互式成分的篩選。通過(guò)這種方法，當(dāng)歸補(bǔ)血湯（DBD）中15種滲透組分通過(guò)聯(lián)機(jī)LC-MS可以同時(shí)預(yù)測(cè)和確定，其中8種成分已經(jīng)被報(bào)道是當(dāng)歸中主要的生物活性成分。與平衡透析相比，微透析結(jié)合HPLC和HPLC-MS已被更廣泛地應(yīng)用于研究中藥與各種靶標(biāo)（如DNA、HAS、微管、乳腺癌細(xì)胞MCF-7等）的相互作用。

細(xì)胞或靶分子的提取是基于假設(shè)中藥中潛在活性成分選擇性地結(jié)合靶細(xì)胞或者一些靶分子，因此，在懸浮液介質(zhì)中的細(xì)胞或靶分子結(jié)合組分的相對(duì)濃度應(yīng)降低，同時(shí)在變性細(xì)胞的提取物中細(xì)胞或靶分子結(jié)合組分也可檢測(cè)到［4］。基于上述提出的方法，冬蟲夏草中潛在的活性成分與當(dāng)歸補(bǔ)血湯、少腹逐瘀湯等配方相結(jié)合，通過(guò)不同的細(xì)胞株（如內(nèi)皮細(xì)胞株，Caco-2細(xì)胞株（結(jié)腸癌細(xì)胞株），巨噬細(xì)胞株，HL-7702細(xì)胞株（人肝細(xì)胞株），RAW264.7細(xì)胞株（小鼠單核巨噬細(xì)胞株）等）提取進(jìn)行了研究［5］。

由于中藥的復(fù)雜性，中藥中每一個(gè)化合物都進(jìn)行純化是不切實(shí)際的，因此，上述文庫(kù)篩選是非常有意義的。除了已知活性的成分，一些未知的潛在活性成分通過(guò)這種方法也可以被檢測(cè)到。另外，這些方法可以同時(shí)捕捉到許多潛在的生物活性成分，可以更好地反映中藥的協(xié)同效應(yīng)和拮抗效應(yīng)。例如，運(yùn)用微透析法或者HPLC法可以測(cè)得來(lái)自于黃連和黃柏中具有相似濃度的黃連素（分別為0.014和0.015mM）與DNA有不同的親和力（分別為48.2%和29.1%）。這些結(jié)果表明存在于提取物中的其他化學(xué)成分與檢測(cè)到的化合物可能具有協(xié)同作用或者拮抗作用。這些方法的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是運(yùn)用HPLC-DAD（ELSD）或者LC-MS技術(shù)聯(lián)用不僅提供更的高分辨率而且提供聯(lián)機(jī)結(jié)構(gòu)鑒定。然而，在進(jìn)行分析時(shí)，該方法的局限性應(yīng)該被考慮，第一，不是每一個(gè)模型都適合于所有的中藥，比如，苦參在DNA模型中沒有發(fā)現(xiàn)任何一種潛在活性成分；第二，不同的篩選方法的平行度不是很好，所以很容易造成混亂，這可能與中藥多靶點(diǎn)多通道的性質(zhì)有關(guān)，例如，DBD的活性成分在不同的篩選方法是不同［5］。就整體而言，這些生物指紋圖譜分析提供了強(qiáng)大且快速的方法來(lái)篩選中藥的生物活性標(biāo)記物，而且其也展現(xiàn)出對(duì)研究中藥與更復(fù)雜的生物系統(tǒng)相互作用的光明未來(lái)。

2.3 代謝指紋圖譜法 自從引入血清藥理學(xué)和血清藥物化學(xué)篩選生物活性成分，這種方法已經(jīng)廣泛用于闡明中藥的治療基礎(chǔ)和作用機(jī)制，通過(guò)對(duì)比中藥的化學(xué)性質(zhì)和其代謝物性質(zhì)。張運(yùn)用HPLC-UV和HPLC-MS分析了丹參注射液的化學(xué)指紋圖譜和代謝指紋圖譜，確定了多酚酸是主要的治療物質(zhì)，同時(shí)建議結(jié)合化學(xué)指紋圖譜和代謝指紋圖譜對(duì)該產(chǎn)品建立一個(gè)強(qiáng)大的質(zhì)量控制模型。除了對(duì)體內(nèi)代謝物研究之外，還建立了一些體外代謝物模型，比如肝組織勻漿和腸細(xì)菌勻漿。

3 結(jié)論

親和色譜法、生物指紋圖譜和代謝指紋圖譜的方法為篩選中藥中潛在的活性化合物提供了新技術(shù)和新方法，這些方法可以幫助我們發(fā)現(xiàn)中藥中潛在的活性成分。

參考文獻(xiàn)

［1］Xie PS，Leung AY.Understanding the traditional aspect of Chinese medicine in order to achieve meaningful quality control of Chinese materia medica［J］.J.Chromatogr.A，2009，1 216（11）：1 933-1940.

［2］Su X，Hu L，Kong L，Lei X，et al.Affinity chromatography with immobilized DNA stationary phase for biological fingerprinting analysis of traditional Chinese medicines［J］.J Chromatogr A，2007，1 154（1-2）：132-137.

［3］Wang Y，Kong L，Lei X，Hu L，et al.Comprehensive two-dimensional high-performance liquid chromatography system with immobilized liposome chromatography column and reversed-phase column for separation of complex traditional Chinese medicine Longdan Xiegan Decoction［J］.J Chromatogr A，2009，1 216（11）：2 185-2 191.

［4］Lei X，Kong L，Zou H，et al.Evaluation of the interaction of bioactive compounds in Cortex Pseudolarix and Radix Stephaniae by the microdialysis probe coupled with high performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2009，1 216（11）：2 179-2 184.

［5］Zhang X，Qi LW，Yi L，et al.Screening and identification of potential bioactive components in a combined prescription of Danggui Buxue decoction using cell extraction coupled with high performance liquid chromatography［J］.Biomed Chromatogr，2008，22（2）：157-163. （責(zé)編：張宏民）