漢防已甲素對內源性神經(jīng)干細胞增殖分化影響的前瞻性研究

羅春山，鄧忠良，邱冰，李青，王遠政，陸庭盛，姚書丹

（重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 骨科，重慶 400010）

漢防已甲素對內源性神經(jīng)干細胞增殖分化影響的前瞻性研究

羅春山，鄧忠良Δ，邱冰，李青，王遠政，陸庭盛，姚書丹

（重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 骨科，重慶 400010）

目的探討漢防己甲素(tetrandrine，Tet)對大鼠急性脊髓損傷(acute spinal cord injury，ASCI)后脊髓損傷段內源性神經(jīng)干細胞(endogenous neural stem cells，ENSCs)增殖分化的影響。方法選用 78 只大鼠，隨機分為 3 組：損傷對照組(n=36)，Tet組(n=36)，假手術組(n=6)。損傷組、Tet組采用 Allen’s打擊法造模，Tet組于脊髓損傷后30 min、術后24 h、術后48 h給予Tet 22．5 mg/kg體重治療，損傷組注射同等劑量的生理鹽水。于脊髓損傷后1 d、3 d、1 w、2 w、3 w、4 w取損傷段脊髓組織，HE染色觀察脊髓組織的形態(tài)結構變化，免疫熒光組織化學方法檢測各組大鼠脊髓組織在不同時間段巢蛋白（Nestin）及BrdU的表達變化情況。結果ASCI后HE染色顯示Tet組脊髓組織損傷較損傷組輕；ASCI后1d損傷對照組及Tet組均可見少量Nestin表達陽性細胞及BrdU表達陽性細胞，ASCI后1 w對照組及Tet組可見大量陽性細胞，陽性細胞表達達高峰，持續(xù)至2 w后逐漸開始下降，ASCI后4 w時，Tet組、損傷對照組中BrdU及Nestin陽性細胞表達數(shù)明顯減少，較假手術組高，但無統(tǒng)計學差異。Tet組BrdU陽性細胞數(shù)量和Nestin陽性細胞數(shù)量在各時間點均高于損傷對照組，其中術后 1 d、3 d、1 w、2 w、3 w 差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），術后 4 w 2 者陽性細胞數(shù)比較無統(tǒng)計學意義。損傷對照組及 Tet組在 ASCI后 1 d、3 d、1 w、2 w、3 w時，與假手術組相比，BrdU、Nestin陽性細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。損傷對照組及 Tet組在 ASCI后 1 d、3 d、1 w、2 w、3 w 時 BrdU、Nestin陽性細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。結論Tet可通過改善微環(huán)境增加BrdU、Nestin陽性細胞，增加ENSCs的增殖，有利于神經(jīng)功能的恢復。

漢防己甲素；脊髓損傷；內源性神經(jīng)干細胞

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 改良Allen垂直下落打擊器：10 g砝碼；直徑0.8 cm的刻度管，作為打擊通道；直徑4 mm的薄金屬片；5-溴2-脫氧嘧啶尿苷、5-溴2-脫氧嘧啶尿苷抗體-3(BrdU Ab-3)購自上海西唐生物科技有限公司；免疫熒光二抗試、FITC標記二抗、免疫組化濕盒、Nestin多克隆抗體、DAB顯色試劑盒(購自武漢博士德)；Tet(純度＞99.9%)購自江西彭澤制藥廠，配置成濃度為2 g/L的溶液，過濾滅菌后備用。

1.2 實驗動物分組 SPF級SD大鼠，體重200～300 g，78只，雌雄不限，購自貴陽醫(yī)學院動物實驗中心，動物許可證號：SCXK（黔）2012--001。隨機分為3組：假手術組6只，損傷對照組36只，Tet治療組36只。

1.3 脊髓損傷模型建立 用4%戊巴比妥鈉麻醉溶液40 mg/kg行腹腔麻醉成功后，四肢與牙齒固定于鼠臺上，手術區(qū)剪毛備皮，碘伏消毒后鋪無菌洞巾，以胸9棘突為中心取后背部正中切口，長約1.5 cm，逐層切開皮膚、皮下，用神經(jīng)剝離子沿棘突兩旁剝離開椎旁肌，眼科鑷提起棘突以便增加椎板間隙，顯微剪剪除胸8、9、10椎板，造成0.4 cm×1.0 cm的椎板缺損，顯露硬膜囊。B、C、D組大鼠把直徑4 mm的薄金屬片置于胸9段脊髓處，按加速壓迫型Allen’s打擊法制成脊髓損傷模型，砝碼重量10 g，沿直徑0.8 cm的刻度試管從5 cm高處自由落下致傷大鼠，可見損傷處脊髓充血明顯、造成脊髓損傷后全癱模型。損傷對照組、Tet治療組制造全癱模型，假手術組大鼠切除椎板后不行打擊損傷，直接縫合。

將1%的5-溴2-脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyuridines，BrdU）生理鹽水溶液在每次處死大鼠前48 h、36 h、24 h開始以50 mg/（kg體重/次）的劑量進行腹腔注射BrdU，以標記脊髓內保持分化活力的細胞，第3次給藥后24 h處死大鼠取標本。Tet治療組于制模術后30 min、傷后24 h、傷后48 h尾靜脈注射濃度為2 g/L的Tet溶液，按22.5 mg/Kg體重，損傷對照組注入同等劑量的生理鹽水作為對照。

1.4 標本采集 假手術組動物于飼養(yǎng)28 d后處死，Tet組及損傷對照組動物分別于術后1 d、3 d、1 w、2 w、3 w、4 w每時間點隨機取6只大鼠處死。4%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉成功后，固定于鼠臺；剪開胸骨打開胸腔經(jīng)左心室心尖處往主動脈插管并固定好，快速滴注4℃生理鹽水200 mL，打開右心耳見清涼液體流出；用灌注泵向主動脈灌注4℃的4%多聚甲醛磷酸緩沖液200 mL，持續(xù)1 h，讓組織固定后取材；從原手術切口打開暴露損傷段脊髓，取損傷段脊髓約6 mm，取出標本后反復用生理鹽水沖洗，PBS液中浸泡沖洗3次，每次5 min，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）內固定12 h后；梯度乙醇(50%、70%、80%、90%、100%)脫水；使用二甲苯透明；組織塊在石蠟中包埋；修剪邊緣平齊后，沿脊髓橫切面切片，制備厚度為3μ m的組織切片；貼片、烤片。備用于HE染色和內源性神經(jīng)干細胞的Nestin和BrdU免疫熒光組化檢測。

1.5 HE染色 在每個時間點每只大鼠取2張組織切片行HE染色，切片脫蠟后清洗、蘇木素染色、洗去片上多余染液，1%鹽酸酒精浸泡分色、堿性溶液促藍后流水沖洗，伊紅復染、梯度乙醇（50%、70%、80%、90%、100%）脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。奧林巴斯光學顯微鏡下觀察脊髓組織的結構形態(tài)變化。

1.6 免疫組織化學染色及圖像分析 每個標本取2張完整的組織切片，每組各個時間點共12張組織切片進行BrdU、Nestin免疫組化染色，陰性對照用正常羊血清替代一抗。封片后鏡檢并照相。奧林巴斯免疫組織化學染色BX-50觀察組織切片，BrdU免疫組織化學染色以細胞內出現(xiàn)棕褐色顆粒為陽性表達，Nestin免疫組織化學染色以胞漿均勻染色呈棕色或褐色為陽性表達，圖像分析由未參與實驗的2名實驗人員實行，在200倍的光學顯微鏡下對脊髓損傷區(qū)進行拍照，計算每張切片隨機選取5個不重疊視野的BrdU陽性表達細胞數(shù)，取其平均值作為每一切片的陽性細胞數(shù)值。

1.7 統(tǒng)計學方法 所得數(shù)據(jù)均經(jīng)過SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，正態(tài)計量數(shù)據(jù)以“±s”表示，各組之間及組內不同時間點之間的兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物模型制作情況 3只大鼠術后傷口感染后死亡，損傷對照組、Tet組共有8只大鼠死亡。術后雙下肢癱瘓是打擊模型成功的標準，假手術組無明顯神經(jīng)功能障礙。

2.2 HE染色結果

假手術組的脊髓組織HE染色正常，未見出血壞死及組織水腫等表現(xiàn)；損傷對照組可見損傷脊髓組織8 h開始出現(xiàn)片狀出血、水腫，1 d時組織呈中重度水腫及神經(jīng)元開始變性，1 w時可見大量神經(jīng)元變性，灰白質有微小空腔形成，4 w時灰白質中出現(xiàn)壞死后形成的囊腔，少量神經(jīng)元殘留；Tet組損傷脊髓組織8 h呈輕度水腫，少量出血，1 d時神經(jīng)元輕中度腫脹，少量神經(jīng)元變性，1 w時組織腫脹開始消退，留有少量點狀壞死灶，4 w組織腫脹基本消退，少量壞死后形成小囊腔，大量神經(jīng)元殘留(見圖1)

圖1 損傷對照組與Tet組1 w、4 w HE染色結果（×100）Fig.1 HE staining of control group and Tet-treated group in one week，four weeks after injury(×100)

2.3 脊髓損傷后BrdU陽性細胞的變化 BrdU染色陽性細胞呈橢圓形、圓形或梭形，陽性細胞呈黃褐色染色，形態(tài)多樣。各組不同時間點脊髓組織中BrdU染色陽性細胞形態(tài)、大小、染色深淺無明顯差異。經(jīng)脊髓橫截面不同區(qū)域觀察發(fā)現(xiàn)BrdU染色陽性細胞主要集聚于脊髓中央管周圍和灰質內。ASCI后1 d即可見少量BrdU陽性細胞，隨時間推移不斷增加，到ASCI后1 w時BrdU陽性細胞數(shù)達高峰，損傷對照組及Tet治療組可見大量陽性細胞，持續(xù)2 w后逐漸下降，分布于損傷區(qū)周圍及脊髓中央管周圍，ASCI后4 w BrdU陽性細胞數(shù)明顯減少，但仍高于假手術組。損傷對照組及Tet組在ASCI后1 d、3 d、1 w、2 w、3 w時與假手術組相比BrdU陽性細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義，ASCI后到第4 w Tet組、損傷對照組數(shù)值較假手術組高，但2組BrdU陽性細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義。Tet治療組BrdU陽性細胞數(shù)量高于損傷組，損傷對照組及Tet組在ASCI后1天時BrdU染色陽性細胞數(shù)量有增加，但2組差異無統(tǒng)計學意義，2組ASCI后在1 d、3 d、3 w時間點BrdU陽性細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義，2組ASCI后在1 w、2 w時BrdU陽性細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義，ASCI后到第4周Tet組數(shù)值較損傷組高，但2組BrdU陽性細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(見表1、圖2)。

表1 損傷組織中brdU免疫組化染色陽性細胞計數(shù)結果Tab.1 Counting results for the number of brdU positive cells by immunohistochemical staining

圖2 脊髓損傷后BrdU陽性細胞變化情況（×200）Fig.2 Results of brdU positive cells in control group and Tet-treated group after injury(×200)

2.4 脊髓損傷后Nestin陽性細胞的變化 Nestin陽性細胞胞核淡染，胞漿深染，呈三角形、梭形或卵圓形。假手術組中可見少量的Nestin陽性細胞。ASCI后1 d時即可見Nestin陽性細胞數(shù)增加，隨時間推移逐漸增加，ASCI后1 w Nestin陽性細胞數(shù)達高峰，損傷對照組及Tet治療組可見大量陽性細胞，持續(xù)2 w后逐漸下降，ASCI后4 w Nestin陽性細胞數(shù)明顯減少，但仍高于假手術組。損傷對照組及Tet組在術后1 d、3 d、1 w、2 w、3 w時與假手術組相比Nestin陽性細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義。Tet治療組表達數(shù)量高于損傷組，2組術后在1 d、3 d、1 w、2 w、3 w時Nestin陽性細胞數(shù)量差異有統(tǒng)計學意義，術后到第4周時2組Nestin陽性細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(見表2、圖3)。

表2 損傷組織中nestin免疫組化染色陽性細胞計數(shù)結果Tab.2 Counting results for the number of nestin positive cells by immunohistochemical staining

圖3 脊髓損傷后Nestin細胞染色結果Fig.3 Results of Nestin positive cells after injury

3 討論

ASCI后原發(fā)性和繼發(fā)性損傷的序貫進行，導致出現(xiàn)脊髓微循環(huán)障礙、自由基損傷、脂質過氧化損傷，免疫炎癥反應等病理現(xiàn)象，引起神經(jīng)元大量變性、壞死致神經(jīng)傳導通路的中斷，最終導致癱瘓等嚴重的神經(jīng)功能障礙。既往已有大量實驗用神經(jīng)干細胞來治療修復脊髓損傷取得了一些進展，但仍存在著很多諸如社會學、論理學、污染、免疫排斥、分化方向控制、致瘤性等問題[4]。

在成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在ENSCs等前體細胞已在近年來的研究中證實，并認為成年哺乳動物脊髓組織中ENSCs主要存在脊髓損傷區(qū)室管膜周圍、膜下區(qū)，在某些病理變化、外傷刺激及炎癥性細胞因子的刺激下可激活、增殖分化和遷移[2-3，5-6]。ENSCs來自自身，方便可靠，無免疫排斥反應、亦無致瘤性之憂。很多實驗發(fā)現(xiàn)將ENSC分離至體外培養(yǎng)時表現(xiàn)出多能分化的特點，能分化為神經(jīng)元，但移植至脊髓后部分神經(jīng)干細胞出現(xiàn)死亡或分化成為形成膠質的星型膠質細胞，而不是分化成為有功能的神經(jīng)元細胞，可能是脊髓損傷后局部微環(huán)境的改變，大量神經(jīng)毒性物質如 NOS、TNF-α、IL-1 β、IL-6、骨形態(tài)發(fā)生蛋白等積聚導致神經(jīng)干細胞的死亡或分化為星形膠質細胞[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)內源性神經(jīng)干細胞非常脆弱，脊髓損傷后大部分死亡，剩下的被激活，分化增殖參與損傷的修復[9]。但實驗證明通過干預因素可促進ENSC增殖分化[10-11]，因此大量研究試想通過人為的干預因素早期競爭性地抑制負性因素，改善微環(huán)境，使神經(jīng)增殖維持時限長、數(shù)量最大化，同時促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，使這些種子細胞能真正參與損傷的修復，促進功能的恢復，已取得了一些正面的成果。本實驗試想利用Tet具有的特殊藥理特性通過改善ASCI后局部微環(huán)境來促進ENSCs增殖分化，以利于修復損傷的脊髓功能[12-13]。

胸腺嘧啶是DNA的基本成分，Brdu是胸腺嘧啶的類似替代物物，在DNA合成期（S期）過程中可被利用替代胸腺嘧啶，BrdU標記陽性細胞就是新生細胞，可作為細胞分裂增殖的示蹤劑[14]。有研究證實BrdU標記陽性細胞90%是具有分化能力的神經(jīng)干細胞，只有10%是已分化細胞，具有很高的特異性[15]。BrdU注入體內后可很快整合到新生DNA中，本實驗在處死大鼠前48 h、36 h、24 h給予腹腔注射Brdu，讓其有充足時間吸收，在這一時期有分化潛能的細胞進行增殖分裂活動，可吸收BrdU替代到新的DNA鏈中，利用免疫組化染色和熒光素作為指示系統(tǒng)可檢測出含有Brdu的細胞，根據(jù)Brdu標記增殖細胞數(shù)量、位置可分析其被激活的ENSCs的增殖速度和在組織中遷徙的路徑，并可追蹤到增殖分裂的子代細胞。本實驗觀察的是ASCI后1 d、3 d、1 w、2 w、3 w、4 w各時間點損傷脊髓組織中前1 d(ASCI后1 d組織采集的標本)或前2 d的ENSCs的增殖細胞數(shù)，因此選擇大鼠處死前2 d給藥。

巢蛋白(Nestin)是一種中間絲蛋白，分布在細胞胞漿中，存在于成年多能干神經(jīng)前體細胞或神經(jīng)干細胞中，系未分化狀態(tài)多能神經(jīng)干細胞的特異性標記抗原蛋白，，目前檢測巢蛋白表達水平是鑒定神經(jīng)干細胞最重要、最常用的手段之一。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，Nestin表達較高，在成熟的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Nestin表達非常低，當中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損傷時，局部微環(huán)境改變刺激神經(jīng)干細胞增殖分化，Nestin表達升高，并在細胞因子的趨化作用下可發(fā)生遷徙，異位表達Nestin，距損傷區(qū)越近，Nestin陽性細胞數(shù)越多，距損傷區(qū)越遠，Nestin陽性細胞數(shù)越少[16]。

本實驗觀察到在正常脊髓組織中Nestin陽性細胞數(shù)量較少，主要集中存在于室管膜周圍，同時在脊髓的灰質和白質中也少見。ASCI后1 d可見Nestin陽性細胞表達增多，位于室管膜區(qū)及脊髓損傷區(qū)，ASCI后1 w時可見Nestin陽性細胞較密集，Nestin陽性細胞數(shù)值達高峰，主要集中位于中央管室管膜周圍及脊髓損傷區(qū)，持續(xù)高表達2 w后逐漸下降，4 w后表達明顯減少，BrdU標記陽性細胞數(shù)值檢測也有相同的規(guī)律，說明在ASCI能激活ENSCs，使處于G0期的ENSCs進入細胞周期，處于活躍的增殖分化狀態(tài)，增殖的ENSCs大量表達Nestin和進行BrdU標記，有一個被激活、增殖分化達高峰、隨著損傷內環(huán)境的穩(wěn)定又逐漸下降的過程。同時損傷后ENSCs活化并在細胞因子的趨化作用下移行至脊髓損傷區(qū)，分化形成新的神經(jīng)元修復損傷脊髓組織。Tet組Nestin陽性細胞數(shù)值和BrdU標記陽性細胞數(shù)值在相同時間點明顯高于損傷組，說明Tet能使更多的ENSCs增殖分化，并積聚到損傷區(qū)域內，為損傷組織修復提供更多的種子細胞，其機制可能是通過改善脊髓損傷后局部微環(huán)境，如減輕局部炎癥反應、抗脂質過氧化、穩(wěn)定生物膜性結構、改善損傷區(qū)微循環(huán)障礙、防止Ca2+過度內流所致的該超載等有關[17]。

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Experimental study of tetrandrine on endogenous neural stem cell proliferation and differentiation

LUO Chun-shan, DENG Zhong-liangΔ, QIU Bing, LI Qing, WANG Yuan-zheng, LU Ting-sheng, YAO Shu-dan

（Department of Osteology, The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China）

ObjectiveTo discuss the effect of tetrandrine on endogenous neural stem cell proliferation and differentiation after spinal cord injury in rats.Methods78 rats were randomly divided into control group(n=36), Tet-treated group(n=36) and sham-operated group(n=6). Control group and Tet-treated group were adapted with Allen's combat modeling method. Rats in Tet group were injected Ted with a dosage 22.5 mg/kg in 30 minutes,24 hours and 48 hours after ASCI, and the same dose of saline was injected into injured group as control .Samples were dissected from the spinal cord injury sites at 1 day, 3 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks after ASCI, and tested by HE staining for morphology and by immunofluorescence staining for the expression of BrdU and nestin.ResultsA little Nestin positive cells and BrdU positive cells were found in control group and Tettreated group at 1 day after injury. A large number of positive cells were found in both groups at 1 week after injury and reached the peak which lasted for 2 weeks and then decreased gradually. The expression of Nestin positive cells and BrdU positive cells in control group and Tet-treated group were decreased significantly at 4 weeks after injury, but were still more than that in sham operation group. The number of Nestin positive cells and BrdU positive cells in Tet-treated group were more than that in control group at each time point after injury. The expression was higher in Tet-treated group than control group at 1 day, 3 days, 1 week, 2 weeks, 3 weeks after injury and had no difference at 4 weeks after injury.ConclusionTetrandrine could increase the number of Nestin positive cells, BrdU positive cells and endogenous neural stem cells though improving the microenvironment, and it is beneficial for the recovery of spinal cord injury in rats.

tetrandrine;spinal cord injury;endogenous neural stem cells

R 651．2

A

1005-1678(2014)02-0026-04

急性脊髓損傷在病理上表現(xiàn)為白質和灰質的損傷，現(xiàn)在普遍認為由原發(fā)性損傷和隨著出現(xiàn)的繼發(fā)性損傷造成。繼發(fā)性損傷是序貫發(fā)生的復雜的自我毀滅的級聯(lián)反應的過程，包括脊髓的低灌注及微循環(huán)障礙所致的缺血缺氧，脂質過氧化作用，興奮性毒性氨基酸等毒性物質的積聚，炎癥介質的瀑布式反應，細胞內鈣超載，能量代謝異常等；其使大量的神經(jīng)元變性壞死、軸突彌漫性脫髓鞘，從而導致?lián)p傷脊髓組織中大量的神經(jīng)元缺失，使患者神經(jīng)功能恢復不理想。近年來研究發(fā)現(xiàn)：在脊髓中央管周圍的室管膜、膜下區(qū)存在內源性神經(jīng)干細胞[1]（endogenous neural stem cells，ENSCs)，正常情況下處于休眠狀態(tài)，脊髓受到損傷時，可刺激室管膜、膜下區(qū)ENSCs增殖分化[2-3]。但在損傷脊髓的微環(huán)境中存在抑制內源性神經(jīng)干細胞增殖分化的負性因素，有利于ENSCs分化成星型膠質細胞和少突膠質細胞，而不利于分化成為促神經(jīng)功能恢復的神經(jīng)元和少突膠質細胞，造成脊髓損傷后功能恢復較差。隨著脊髓損傷機制研究的深入，認為繼發(fā)性損傷有可干預性，在早期減輕繼發(fā)性損傷能保護殘余脊髓組織、促進脊髓功能的修復。漢防己甲素是中藥防己的有效成分，大量研究證明其具有抗炎、抗脂質過氧化、防止細胞受損、改善微循環(huán)及Ca2+拮抗作用。本實驗主要探討Tet對內源性神經(jīng)干細胞增殖分化的影響來觀察其對ASCI后神經(jīng)功能的恢復。

貴州省科技英才項目資助[黔省專合字（2012）176號]

羅春山，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：脊髓損傷的基礎研究，E-mail：lyz 8088 gk@163.com；鄧忠良，通信作者，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：脊髓損傷的基礎研究，E-mail：deng 7568@gmail.com。