香菇多糖對平陽霉素抑制血管內(nèi)皮瘤細胞增殖的影響

付桂莉，鄭源泉，盧靜靜，黃美蓮，李延

(1.武漢市兒童醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430016；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430022)

香菇多糖對平陽霉素抑制血管內(nèi)皮瘤細胞增殖的影響

付桂莉1，鄭源泉1，盧靜靜1，黃美蓮1，李延2

(1.武漢市兒童醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430016；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院 皮膚科，湖北 武漢 430022)

目的研究香菇多糖對平陽霉素抑制血管內(nèi)皮瘤細胞的增殖的影響。方法將EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞分別單用香菇多糖處理（LTN組）、單用平陽霉素處理（BLE組）、香菇多糖聯(lián)合平陽霉素處理（L+B組）和未做任何處理（CON組），比較4組細胞處理前后細胞增殖和凋亡的差異。結(jié)果 CON組和LTN組作用后d 1-d 7的吸光度無顯著差異，但均顯著高于BLE組和L+B組（P＜0．05）；L+B組作用后d 1-d7的吸光度顯著低于BLE組（P＜0．05）。BLE組和 L+B組 G 0/G1期和凋亡率顯著高于 CON組和 LTN組（P＜0．05），S期、G 2/M期和 PI顯著低于 CON組和 LTN組（P＜0．05）；L+B組G 0/G1期和凋亡率顯著高于BLE組（P＜0．05），S期、G 2/M期和PI顯著低于BLE組（P＜0．05）。結(jié)論香菇多糖可顯著增強平陽霉素對小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞抑制增殖及促進凋亡的作用。

血管瘤；平陽霉素；香菇多糖；細胞增殖；凋亡

香菇多糖是臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物，其作用機制與提高機體T淋巴細胞免疫和細胞毒性T細胞的殺傷作用有關(guān)，而香菇多糖自身對腫瘤細胞無直接抑制作用[1-2]。平陽霉素是由博萊霉素類抗腫瘤抗生素，能抑制腫瘤細胞DNA的合成，影響腫瘤細胞代謝，對多種腫瘤細胞具有殺滅作用[3-4]。本研究采用香菇多糖聯(lián)合平陽霉素處理血管內(nèi)皮瘤細胞，探討香菇多糖體外對平陽霉素抑制血管瘤內(nèi)皮細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，胎牛血清和DMEM購自Gibco公司，MTT試劑購自碧云天公司，香菇多糖購自南京康海藥業(yè)有限公司，平陽霉素購自天津太河制藥有限公司（國藥準字：H12020933）。

1.2 細胞培養(yǎng)和藥物處理 EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞完全培養(yǎng)基為10%胎牛血清和90%DMEM，培養(yǎng)在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱。香菇多糖經(jīng)DMEM配制成1μmol/mL處理液，平陽霉素用生理鹽水配制成1 mg/mL處理液。根據(jù)藥物處理EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞方法分成CON組（僅完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，未加入香菇多糖和平陽霉素）、LTN組（僅加入香菇多糖，香菇多糖終濃度0.1 μmol/L）、BLE組（僅加入平陽霉素，平陽霉素終濃度0.1 mg/mL）和L+B組（加入香菇多糖和平陽霉素，香菇多糖終濃度0.1 μmol/L，平陽霉素終濃度0.1 mg/mL）。4組細胞藥物處理24 h后PBS清洗3次，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，檢測其增殖和凋亡。

1.3 檢測指標及方法，細胞增殖：采用MTT法檢測，檢測處理前（d 0）和處理d 1～d 7后酶標檢測儀檢測490 nm下的吸光值（A）并繪制細胞增殖曲線；細胞周期和凋亡：采用流式細胞儀檢測細胞周期及細胞凋亡，增殖指數(shù)（PI）=（S+G 2/M）/（G0/G1+S+G2/M）。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)計量資料采用“±s”表示。4組間均數(shù)兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖比較結(jié)果 4組EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞藥物作用前吸光度無明顯差異，藥物處理后4組細胞d 1-d 7吸光度逐漸升高；CON組和LTN組作用后d 1-d 7的吸光度無顯著差異，但均顯著高于BLE組和L+B組（P＜0.05）；L+B組作用后d 1-d 7的吸光度顯著低于BLE組（P＜0.05，見圖1）。

圖1 4組EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞d 0～d 7吸光值Fig.1 Absorbance of EOMA cells in d 0～d 7 after treatment in four groups*P＜0.05，與CON組和LTN組相比，compared with CON group and LTN group；﹟P＜0.05，與 BLE 組對比，compared with BLE group

2.2 細胞周期和凋亡比較 CON組和LTN組EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞G0/G1期、S期、G2/M期、PI和凋亡率的差異無統(tǒng)計學意義；BLE組和L+B組G0/G1期和凋亡率顯著高于CON組和LTN組（P＜0.05），S期、G2/M期和PI顯著低于CON組和LTN組（P＜0.05）；L+B組G0/G1期和凋亡率顯著高于BLE組（P＜0.05），S期、G2/M期和PI顯著低于BLE組（P＜0.05）（見表 1）。

表1 4組EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞細胞周期和凋亡對比（%）Tab.1 Comparision of cell cycle, PI and apoptosis rates in EOMA cells among four groups(%)

3 討論

平陽霉素是平陽鏈霉菌產(chǎn)生的博萊霉素類抗腫瘤抗生素，能抑制腫瘤細胞DNA的合成，影響腫瘤細胞代謝，促進癌細胞變性、壞死，體內(nèi)外實驗證明平陽霉素肝癌、消化道腫瘤和血管瘤等腫瘤細胞均有較強的殺滅作用[5-7]。平陽霉素為細胞周期非特異性藥物，研究表明平陽霉素產(chǎn)生的OH-與DNA結(jié)合，抑制DNA復制，將細胞阻滯在G0/G1期和S期，這種抑制作用呈劑量依賴性[8-9]。平陽霉素的抗腫瘤作用還與其誘導腫瘤細胞凋亡有關(guān)，高濃度的平陽霉素可誘導腫瘤細胞啟動程序性死亡程序。香菇多糖是典型的T細胞激活劑，在臨床上廣泛應(yīng)用于各種腫瘤的治療，可顯著提高抗腫瘤藥物的療效并降低其不良反應(yīng)，因香菇多糖自身對腫瘤細胞無直接殺滅作用，故目前對香菇多糖在體外中能否增強抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的殺滅作用尚存在極大爭議。本研究中，L+B組EOMA小鼠血管內(nèi)皮瘤細胞d 1-d 7的吸光度顯著低于BLE組（P＜0.05），而G0/G1期和凋亡率顯著高于BLE組（P＜0.05），S 期、G2/M期和 PI顯著低于 BLE 組（P＜0.05），證實平陽霉素對腫瘤細胞增殖抑制及促進凋亡作用，同時表明體外實驗中香菇多糖可增強平陽霉素對腫瘤細胞的殺滅作用。

本研究中，CON組和LTN組作用后d 1～d 7的吸光度、G0/G1期、S期、G2/M期、PI和凋亡率無明顯差異，證實香菇多糖自身對腫瘤細胞增殖和凋亡無明顯作用。體內(nèi)實驗表明香菇多糖通過改善機體免疫功能而增強抗腫瘤藥物的抗腫瘤作用，而在體外細胞實驗中無體內(nèi)免疫環(huán)境，故香菇多糖體外增強化療藥物的抗腫瘤作用可能存在其他作用機制[10]。體外細胞實驗表明香菇多糖可抑制腫瘤細胞耐藥基因的表達，從而增加腫瘤藥物在腫瘤細胞內(nèi)的濃度[11]。目前發(fā)現(xiàn)耐藥基因包括多藥耐藥基因（multidrug resistance gene 1，MDR 1）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance protein，MRP）和肺耐藥蛋白（lung resistance protein，LRP），MDR可利用ATP水解功能將抗腫瘤藥物泵出胞膜外；MRP可將帶負電荷的藥物分子逆濃度泵出到細胞外，降低抗腫瘤藥物在細胞內(nèi)的濃度，同時改變細胞內(nèi)的pH值，抑制抗腫瘤藥物與靶點的結(jié)合；LRP可阻止抗腫瘤藥物進入細胞核，還可將進入胞漿的抗腫瘤藥物轉(zhuǎn)運到運輸囊泡中，通過胞吐的方式排出細胞外[12-13]。體內(nèi)外細胞實驗表明，腫瘤細胞存在原發(fā)耐藥基因表達，采用大劑量平陽霉素可誘導腫瘤細胞MRP和P-gp表達增加從而產(chǎn)生耐藥性，而逆轉(zhuǎn)耐藥基因表達后可增強平陽霉素對其的殺滅作用[14-15]?；谶@些證據(jù)，推測本研究中香菇多糖是通過降低耐藥基因的表達從而提高平陽霉素對血管內(nèi)皮瘤細胞的抑制增殖和促進凋亡作用。

[1] Zhao L,Xiao Y,Xiao N．Effect of lentinan combined with docetaxel and cisplatin on the proliferation and apoptosis of BGC 823 cells[J]．Tumour biology 2013 34(3)：1531-1536．

[2] Wang JL,Bi Z,Zou JW,et al．Combination therapy with lentinan improves outcomes in patients with esophageal carcinoma[J]．Mol Med Rep,2012,5(3)： 745-748．

[3] Yang Y,Sun M,Ma Q,et al．Bleomycin A 5 sclerotherapy for cervicofacial lymphatic malformations[J]．Journal of vascular surgery,2011,53(1)：150-155．

[4] Hou R,Guo J,Hu K,et al．A clinical study of ultrasound-guided intralesional injection of bleomycin A 5 on venous malformation in cervical-facial region in China[J]．Journal of vascular surgery,2010,51(4)：940-945．

[5] Aouida M,Ramotar D．A new twist in cellular resistance to the anticancer drug bleomycin-A 5[J]．Current drug metabolism,2010 11(7)：595-602．

[6] 劉曦，羅小平，曹聞挺，等．平陽霉素混合碘油經(jīng)動脈化療栓塞抑制兔VX2肝癌生長的實驗研究[J]．中華肝臟病雜志，2012，20（8）：611-616．

[7] 王瑩，吳淑英，甄永蘇，等．蛋白酶抑制劑leupeptin增強抗腫瘤藥物對腫瘤細胞的增殖抑制作用[J]．醫(yī)學研究雜志，2012，41（10）：56-60．

[8] 李鵬，肖小娥，郭正團，等．平陽霉素對嬰幼兒血管瘤細胞系 XTPS-1作用的實驗研究[J]．中華口腔醫(yī)學雜志，2012，47（6）：324-328．

[9] 賈玉林，趙怡芳，賈俊，等．平陽霉素對人靜脈畸形內(nèi)皮細胞增殖活性和細胞形態(tài)的影響[J]．華中科技大學學報（醫(yī)學版），2011，40（6）：674-677．

[10] 葉茂，周毅．順鉑聯(lián)合香菇多糖對肺癌并發(fā)惡性胸腔積液患者胸水調(diào)節(jié)性T細胞的影響及意義[J]．浙江醫(yī)學，2014，（2）：124-126，129．

[11] 袁昌勁，孔慶志，盧宏達，等．香菇多糖增強5-FU抑制結(jié)腸癌細胞增殖機制研究[J]．中國實驗診斷學，2012，16（6）：992-994．

[12] 何志惠，蘇群豪，洪濤，等．非小細胞肺癌 P-gp、LRP表達及其與預后的相關(guān)性[J]．中國老年學雜志，2013，33（16）：3832-3833．

[13] Baumert C,Gunthel M,Krawczyk S,et al．Development of small-molecule P-gp inhibitors of the N-benzyl 1,4-dihydropyridine type：novel aspects in SAR and bioanalytical evaluation of multidrug resistance (MDR) reversal properties[J]．Bioorganic and medicinal chemistry,2013,21(1)：166-177．

[14] 王青，孫小蘭，羊小海，等．單分子力譜研究活細胞上多藥耐藥相關(guān)蛋白1的表達[J]．高等學校化學學報，2012，33（7）：1401-1406．

[15] 張瓊，鄭國沛，譚小軍，等．平陽霉素誘導的人舌癌多藥耐藥相關(guān)蛋白質(zhì)表達譜的建立[J]．國際病理科學與臨床雜志，2012，32（3）：193-199．

Effects of lentinan on bleomycin A5’s inhibition effects in hemangioma-derived endothelial cell

FU Gui-li1, ZHENG Yuan-quan1, LU Jing-jing1, HUANG Mei-lian1, LI Yan2

(1.Department of Dermatology, Wuhan Children's Hospital, Wuhan 430016,China; 2.Department of Dermatology, Union Hospital, Tongji Medical college, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022,China)

ObjectiveTo study the effects of Lentinan on bleomycin A5’s inhibition effects in hemangioma-derived endothelial cell.MethodsHemangioma-derived endothelial cell line EOMA were divided into LTN group (only lentinan treatment), BLE group (only bleomycin A 5 treatment),L+B group (Lentinan and bleomycin A5 treatment) and CON group (no lentinan and bleomycin A5 treatment). Cell proliferation, cell cycle, PI and apoptosis were detected and compared among four groups.ResultsThe differences of absorbance in LBE group was significantly higher than that in L+B group after treatment for d 1-d 7 (P＜0.05), but both of them were significantly lower than in CON group and LTN group (P＜0.05). The G 0/G 1 stage and apoptosis rate in L+B group was significantly higher than in BLE group(P＜0.05), while it was significantly lower in S stage, G 2/M stage and PI(P＜0.05).ConclusionLentinan could significantly enhance bleomycin A5’s inhibition effects on hemangioma-derived endothelial cell.

hemangioma; bleomycin A5; lentinan; cell proliferation; apoptosis

R 735

A

1005-1678(2014)02-0020-02

國家自然科學基金青年科學基金（30901287）

付桂莉，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：兒童皮膚疾病診斷與治療，E-mail：157047064@qq.com。