中藥甘遂致小鼠肝臟氧化損傷的機制研究

張秀娟，陸童，楊波，刁茜

（1.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥劑科，黑龍江 哈爾濱 150040）

中藥甘遂致小鼠肝臟氧化損傷的機制研究

張秀娟1，2，3，陸童3，楊波1，2，3，刁茜4

（1.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 藥劑科，黑龍江 哈爾濱 150040）

目的探討中藥甘遂所致小鼠肝臟氧化損傷的作用機制。方法昆明種小鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，分別為4 g／kg組（1／8 LD50）、2 g／kg組（1／16 LD50）、1 g／kg組（1／32 LD50）及正常對照組，連續(xù)灌胃給藥21 d后測定小鼠體質(zhì)量及肝臟臟器系數(shù)；HE染色觀察各組小鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化；紫外分光光度法測定各組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine amiotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）酶活性；肝組織超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidases，GSH-Px）水平，丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧陰離子自由基（O2-·）、羥自由基（OH·）含量的變化，流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的變化。結(jié)果隨著甘遂劑量增加，小鼠體質(zhì)量明顯下降，肝臟臟器系數(shù)顯著升高（P＜0.05）；血清 ALT和 AST活性顯著升高（P＜0.05）；肝組織 SOD、GSH-PX活性顯著降低（P＜0.05）、MDA含量顯著升高（P＜0.05）；肝組織氧自由基O2-·、OH·、ROS含量顯著增高（P＜0.05）。結(jié)論甘遂通過脂質(zhì)過氧化作用而引起肝損傷。

甘遂；肝功能；酶活性；氧化損傷

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 甘遂購于哈爾濱市人民同泰大藥房，批號20110926，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院張德連副教授鑒定為大戟科（Euphobiaceae）大戟屬（Euphorbia）植物甘遂 Euphorbia kansuiT.N.Liou ex T.P.Wang的干燥塊根。

1.1.2 動物 昆明種小鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g，合格證號為黑動字第POO101006號，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心繁殖提供。

1.1.3 試劑 谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine amiotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物（glutathione peroxidases，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、羥自由基、超氧陰離子自由基及產(chǎn)生超氧陰離子自由基、考馬斯亮蘭蛋白試劑盒，均購自南京建成生物科技有限公司；ROS試劑盒，北京碧云天公司。

1.1.4 儀器 JY3001電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；Adventurer萬分之一電子天平（OHAUS公司）；QL-861型渦旋混合振蕩器（江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠）；低溫高速冷凍離心機（美國Sigma）；尤尼柯 UV-210紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；FSH-2型可調(diào)高速勻漿器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；RM2126型切片機（德國LEICA公司）；C-4040ZOOM型數(shù)碼相機（Olympus公司）；EPICS XL-MCL流式細(xì)胞儀（美國BECK-MAN-COULTER公司）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組與給藥 甘遂磨粉，200目篩濾。昆明種小鼠40只，隨機分成4組，雌雄各半。灌胃給藥21 d，劑量分別為 1／8 LD50（1 g／kg甘遂組）、1／16 LD50（2 g／kg甘遂組）、1／32 LD50（4 g／kg甘遂組），正常對照組給予等體積蒸餾水。

1.2.2 甘遂對小鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響 臟器系數(shù)（%）＝臟器濕重（g）／體質(zhì)量（g）×100%。

1.2.3 甘遂對小鼠肝臟組織形態(tài)的影響 取各組小鼠肝臟組織，HE染色后光鏡下觀察臟器組織結(jié)構(gòu)病理改變情況。

1.2.4 甘遂對小鼠血清ALT、AST活性的影響 灌胃給藥21d后各組小鼠眼球取血約2mL，3000 r／min離心10min，分離血清。505 nm處測吸光度值。根據(jù)測定管吸光度與對照管吸光度差值，查找ALT標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得ALT、AST活力單位。

1.2.5 甘遂對小鼠肝臟SOD、GSH-Px和MDA的影響 小鼠處死后取肝臟0.3 g，用冷0.86%生理鹽水漂洗，研磨成10%組織勻漿，4℃離心3000 r／min，10～15min，留上清。595 nm處，蒸餾水調(diào)零，測OD值。

1.2.6 甘遂對小鼠肝臟OH·和O2-·的影響 按照試劑盒說明書要求于595 nm測OD值。

1.2.7 小鼠肝組織中ROS含量的測定 取適量肝臟組織，PBS沖洗，胰酶37℃消化15 min，小牛血清中止，300目篩網(wǎng)過濾，500 r／min離心 3次，每次 2 min，收集沉淀細(xì)胞，加 1 mL 0.83%的氯化銨，1500 r／min離心10min。取900μL細(xì)胞懸液，加染色液100μL，使其終濃度為10μM，37℃孵育30 min，加1mL無血清培養(yǎng)液，1000 r／min離心10min，再加1m L無血清培養(yǎng)液洗滌，1000 r／min離心10min，加入1mL無血清培養(yǎng)液，過300目網(wǎng)，流式細(xì)胞儀檢測。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，組間比較采用用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 甘遂對小鼠體質(zhì)量和臟器系數(shù)的影響 給藥21 d后，與正常對照組相比，各甘遂給藥組小鼠體質(zhì)量明顯下降，其中4 g／kg組體質(zhì)量下降最為顯著；各甘遂給藥組肝臟臟器系數(shù)明顯升高，其中2 g／kg組和4 g／kg組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01，見表1）。

表1 甘遂對小鼠肝臟臟器系數(shù)的影響Tab.1 Effects of kansui on the liver index ofmice

2.2 甘遂對小鼠肝臟組織形態(tài)的影響 HE染色結(jié)果顯示：正常對照組小鼠肝細(xì)胞未見變性、壞死，無炎性細(xì)胞浸潤；1 g／kg甘遂組的小鼠肝臟基本正常，偶見壞死灶；2 g／kg甘遂組肝細(xì)胞少量空泡變性，偶見壞死灶；4 g／kg甘遂組小鼠肝細(xì)胞多數(shù)呈壞死灶（見表1）。表明小鼠肝細(xì)胞內(nèi)壞死灶數(shù)量隨甘遂給藥劑量的增加而增多。

圖1 甘遂對小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響（×400）Fig.1 Effects of kansui on the livermorphology ofmice（×400）

2.3 甘遂對小鼠血清中ALT、AST活性的影響 與正常對照組相比，各給藥組血清中ALT和AST活性明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。且隨著劑量的升高，活性也相應(yīng)升高，呈劑量依賴性（見表2）。

表2 甘遂對小鼠血清ALT和AST活性的影響（U／L）Tab.2 Effects of kansui on the serum ALT and AST ofmice（U／L）

2.4 甘遂對小鼠肝臟SOD、GSH-Px和MDA活性的影響與正常對照組相比，各甘遂給藥組SOD和GSH-Px活性均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。且活性隨著給藥劑量的增加而降低，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。各甘遂給藥組MDA含量均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），且含量隨著給藥劑量的增加而增加（見表3）。

表3 甘遂對小鼠肝臟SOD、GSH-Px和MDA活性的影響Tab.3 Effects of kansui on the Liver SOD、GSH-Px and MDA ofmice

2.5 甘遂對小鼠肝臟OH·和O2-·的影響 與空白組相比，各給藥組小鼠肝組織的OH·、O2-·均顯著升高（P＜0.01），且隨著甘遂劑量的增加OH·、O2-含量不斷升高，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。氧自由基的含量升高說明甘遂對小鼠肝臟有一定的氧化損傷。

表4 甘遂對小鼠肝臟OH· 和O2-·的影響Tab.4 Effects of kansui on the liver OH· and O2-·ofmice

2.6 甘遂對小鼠肝細(xì)胞ROS的影響 與正常組相比，肝細(xì)胞中ROS含量明顯升高，且隨著劑量的增加含量都升高，呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系（見圖2）。

圖2 甘遂對小鼠肝細(xì)胞ROS的影響Fig.3 Effect on the ROS ofmice-liver cell of kansui

3 討論

肝臟是人體重要的的消化腺體，是人體最主要的代謝器官和防御器官。人體代謝產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)和通過各種途徑進入人體的外源性化學(xué)物質(zhì)最終都在肝臟內(nèi)進行轉(zhuǎn)化或貯留，各種有害的物質(zhì)均可引起急慢性肝損傷，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死和凋亡、纖維化、炎癥等病理改變［8］。

實驗中各給藥組小鼠肝臟臟器系數(shù)較正常對照組明顯升高，通過觀察發(fā)現(xiàn)各給藥組小鼠較空白組相比肝臟體積明顯增大，且顏色較深。隨著甘遂給藥濃度的增高，肝臟顏色逐漸加深，顯微鏡下肝臟病理變化越嚴(yán)重。臟器系數(shù)增大，表示臟器可能充血、水腫、增生、肥大等變化。同時各給藥組小鼠血清中的ALT、AST的活性明顯高于空白組，說明給藥后，小鼠的肝功能受到了一定程度的損傷。ALT主要分布于肝細(xì)胞細(xì)胞漿水溶性的部分，AST則分布于肝細(xì)胞細(xì)胞漿水溶性的部分和線粒體中，在肝臟等臟器組織受到損傷或壞死時，細(xì)胞內(nèi)酶釋放，流入血液，就會引起血清中相應(yīng)酶活力的升高［9］，其升高的程度可間接反應(yīng)肝細(xì)胞受損的程度，由于整個肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶活力比血清內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶總活力高成百上千倍，因此肝細(xì)胞只要有1%發(fā)生壞死，便可使血清酶活力升高1倍，在排除肝臟以外的臟器發(fā)生病變的情況下，血清內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶升高，就在一定程度上反映了肝細(xì)胞損傷和壞死的程度，因此通過結(jié)果可以說明甘遂對小鼠肝功能有一定的影響。而SOD和GSH-Px的各給藥組與正常組相比活性降低，差異顯著，且活性隨著劑量的增加而降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。MDA含量升高，細(xì)胞膜表面高濃度的氧與還原劑發(fā)生自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，反應(yīng)終產(chǎn)物（主要是MDA）引起膜蛋白的共價交聯(lián)與聚合，使細(xì)胞膜處于永久性締合狀態(tài)，嚴(yán)重影響了膜蛋白的流動性，導(dǎo)致膜功能的喪失，使肝細(xì)胞腫脹、壞死，實驗中抗氧化酶的活性降低，而氧化產(chǎn)物的含量增高［10-12］，說明甘遂對小鼠肝臟具有一定的氧化損傷作用。

生物體內(nèi)自由基生成反應(yīng)的一大特點是它們往往以鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進行，正常生理狀態(tài)下，氧自由基不斷產(chǎn)生，也不斷被清除，處于動態(tài)平衡狀態(tài)，不會出現(xiàn)細(xì)胞損傷，但在病理情況下，氧自由基的產(chǎn)生與清除之間平衡的關(guān)系被打破，導(dǎo)致體內(nèi)氧自由基產(chǎn)生過多或清除不足［13］，過度激活的氧自由基，可與細(xì)胞膜上多不飽和脂肪酸反應(yīng)，發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用，也是甘遂致使小鼠肝損傷的主要機制。

綜上所述，甘遂通過脂質(zhì)過氧化作用引起肝臟的損傷。

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（編校：吳茜）

Study on themechanism of peroxidant damage in liver induced by Traditional Chinese M edicine Euphorbia kansui

ZHANG Xiu-juan1，2，3，LU Tong3，Yang Bo1，2，3，DIAO Qian4

（1.Institute of Bio-safety Evaluation，Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；2.Engineering Research of Natural Anticancer Drugs，Ministry of Education，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；3.School of Pharmacy，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China；4.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

ObjectiveTo study themechanisms of Chinesemedicine Euphorbia kansui induced liver damage.Methods40 miceswere selected and radom ly divided into four groups according to the dose of Chinese medicine Euphorbia kansui used，there were 4 g／kg group（1／8 LD50），2 g／kg group（1／16 LD50），1 g／kg group（1／32 LD）50，and control group，which were given saline.After continuous administration for 21 d by ig，the body weight and liver coefficient ofmice in all groupswere determined，liver histological changeswere detected by HE staining.The serum enzymatic activity of alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST），the levelsof superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSHPx），the content of malondialdehyde（MDA），superoxide anion radical（O2-·）and hydroxyl radical（OH·）were all measured by ultraviolet spectrophotometry.The changes of reactive oxygen species（ROS）contentwere detected by flow cytometry.ResultsWith the increase dose of Chinese medicine Euphorbia kansui，the body weightof ratswere decreased，and liver coefficientwere increased（P＜0.05）.The serum ALT，AST activity were significantly increased，SOD and GSH-Px activity were significantly decreased（P＜0.05），MDA content were increased significantly，radical O2-·，OH·and intracellular ROS levelswere all increased（P＜0.05）.ConclusionChinese medicine Euphorbia kansui induced liver injury though lipid peroxidation.

Chinesemedicine Euphorbia kansui；liver function；enzyme activity；oxidative damage

R285.5

A

1005－1678（2014）04－0063－04

甘遂在我國的應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為下品，《本草綱目》將其列入草部毒草類。甘遂為大戟科（Euphorbiaceace）大戟屬（Euphorbia genus）多年生草本植物甘遂Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang的干燥塊根［1］，甘遂具有瀉水飲、破積聚、通二便等功效，常用于治療水腫脹滿、留飲、結(jié)胸、噎隔、癲痛、二便不通等癥，臨床上常用于治療晚期食道癌、乳腺癌等惡性腫瘤以及慢性支氣管炎、哮喘等癥［2-5］。通常認(rèn)為其毒性較強，臨床用量也十分有限，過量則會引起腹痛、腹瀉，嚴(yán)重時會出現(xiàn)劇烈嘔吐、血壓下降、脫水甚至呼吸衰竭等癥狀，炮制后可降低其毒性，緩和其峻瀉作用，故臨床上常使用甘遂炮制品，但近年來一些文獻報道甘遂生品多應(yīng)用于治療肝硬化腹水、急性腸梗阻、重癥急性胰腺炎等癥［6-7］，往往在治療效果不佳時加入甘遂生品會起到很好的療效，但是也不應(yīng)忽視其毒性，因此本文就甘遂所致小鼠肝臟氧化損傷機制進行了研究。

張秀娟，女，博士，教授，研究方向：抗腫瘤藥物，E-mail：zhangmu77＠163.com。