ULF基因沉默對(duì)依托泊苷引起的非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞凋亡的影響

劉偉，徐鑫，曹曉慈，袁菲，方會(huì)英

（1.河北中醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河北 石家莊 050000；2.河北省人民醫(yī)院 急診科，河北 石家莊 050000；3.河北省人民醫(yī)院腫瘤二科，河北 石家莊 050000；4.山東棗莊職業(yè)學(xué)院 口腔系，山東 棗莊 277000）

ULF基因沉默對(duì)依托泊苷引起的非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞凋亡的影響

劉偉1，徐鑫2，曹曉慈3，袁菲4，方會(huì)英4

（1.河北中醫(yī)學(xué)院護(hù)理學(xué)院，河北 石家莊 050000；2.河北省人民醫(yī)院 急診科，河北 石家莊 050000；3.河北省人民醫(yī)院腫瘤二科，河北 石家莊 050000；4.山東棗莊職業(yè)學(xué)院 口腔系，山東 棗莊 277000）

目的探討RNA干擾靶向抑制ULF的表達(dá)對(duì)化療藥物依托泊苷（etoposide）引起的非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞凋亡的影響。方法設(shè)計(jì)3條針對(duì)ULF基因的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）片段及1條陰性對(duì)照siRNA，分別在慢病毒載體介導(dǎo)下感染H1299細(xì)胞。用real-time PCR及Western印跡法篩選出1條抑制效率最高的ULF序列，對(duì)有效干擾組和對(duì)照干擾組細(xì)胞進(jìn)行etoposide處理，干擾對(duì)照細(xì)胞或沉默ULF的H1299細(xì)胞，用c-PARP做標(biāo)記物檢測(cè)H1299細(xì)胞的凋亡程度，MTT法檢測(cè)H1299細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。結(jié)果經(jīng)感染ULF-shRNA-1序列的H1299細(xì)胞中ULFmRNA及蛋白表達(dá)降低最為明顯，抑制率達(dá)80%，選擇該條siRNA作為有效干擾組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western blot結(jié)果顯示etoposide處理后，有效干擾組H1299細(xì)胞凋亡水平顯著增加，細(xì)胞增殖抑制率顯著高于對(duì)照干擾組，并與etoposide劑量呈正相關(guān)，2組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。流式結(jié)果顯示有效干擾組G0／G1期細(xì)胞較對(duì)照組增加，S期細(xì)胞減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論etoposide處理后通過(guò)干擾ULF蛋白表達(dá)可誘導(dǎo)H1299細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞出現(xiàn)S期阻滯，推測(cè)ULF基因可能成為癌癥基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。

ULF；H1299細(xì)胞；肺癌；依托泊苷

1 材料與方法

1.1 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，Taq酶均購(gòu)自 Takara公司。慢病毒系統(tǒng)由轉(zhuǎn)移載體、pGag／Pol、pRev、pVSV-G 4種質(zhì)粒組成。Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司，H1299細(xì)胞購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)，莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自Promega公司，DMEM培養(yǎng)基及胰酶購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。Actin、ULF／TRIP12（E-14）、c-PARP抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，MTT溶液（5%四甲基偶氮唑藍(lán)）購(gòu)自上海華美生物工程公司。恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、冷凍超速離心機(jī)、熒光倒置顯微鏡均購(gòu)于上海博訊儀器。數(shù)碼凝膠處理系統(tǒng)購(gòu)于天能科學(xué)儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì)與合成：按siRNA序列設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)siRNA，并將選出的siRNA序列進(jìn)。

1.2.2 行BLAST搜索作同源性分析，以保證序列的特異性。最后確定 3條 siRNA序列：5’-GGTAGTGACTCCACCCATTTT-3’，5’-GAACACAGATGGTGC-GATATT-3’，5’-GACAAAGACTCATAC AATATT-3’。構(gòu)建表達(dá)shRNA的慢病毒載體將針對(duì)ULF基因的3個(gè)shRNA的DNA Oligo（內(nèi)含XhoI＋Hpa I酶切位點(diǎn)），經(jīng)退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)Xho I＋Hpa I酶切后的pLL3.7載體連接，轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌，每個(gè)連接反應(yīng)挑取5個(gè)菌落，接種到含50μg／mL Ampicillin的LB培養(yǎng)基中。使用堿裂解法抽提質(zhì)粒，將陽(yáng)性重組載體的克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.3 慢病毒包裝：慢病毒包裝需要的3個(gè)蛋白Gag／Pol、Rev、VSV-G，分別獨(dú)立放置在 3個(gè)質(zhì)粒 pMDL、pRev、pVSVG上，產(chǎn)生的慢病毒為非復(fù)制型病毒，安全性好。慢病毒的包裝在293T細(xì)胞中完成，具體如下：按照 pLL 3.7 6μg，pMDL 3μg，pREV 3μg，pVSVG 3μg的比例配好質(zhì)粒，采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。培養(yǎng)48～54 h，收集細(xì)胞上清，先經(jīng)離心3 500 g，5min，去除大的細(xì)胞碎片，再經(jīng)過(guò)0.45μm一次性濾器過(guò)濾。病毒溶液在EP管中液氮速凍后，凍存在－80℃冰箱中保存。

1.2.4 非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞培養(yǎng)：H1299細(xì)胞株接種于含10%胎牛血清、100μg／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。PBS洗滌、胰酶消化、離心、傳代。

1.2.5 慢病毒感染H1299細(xì)胞：收集到的病毒根據(jù)所需量，在終濃度8μg／mL polybrene存在下加入到50%左右密度的細(xì)胞中，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h；根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)直至侵染72 h。慢病毒載體上含有綠色熒光蛋白GFP基因編碼區(qū)，通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達(dá)，以判斷慢病毒的感染效果。

1.2.6 RNA的提取及 Real Time PCR：H1299感染 ULF-shRNA 72 h后，按照天根RNA提取試劑盒操作手冊(cè)提取RNA，測(cè)定OD260和OD280值。明確RNA濃度和純度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，Primer 5.0設(shè)計(jì)ULF的引物序列，由生工生物工程（上海）有限公司合成，ULF上游引物 5’-ATGTCCAACCGGCCTAATA-3’，下游引物 5’-GCAGGTGCCTAAGAAAGAC-3’。GAPDH作為內(nèi)參，上游 引 物 5’-GACATCAAGAAGGTGGTGAA-3’，下 游 引 物 5’-TGTCATACCAGGAAATGAGC-3’。用上述引物進(jìn)行Real Time PCR。

1.2.7 蛋白印跡法：細(xì)胞裂解液分別抽提對(duì)照組與ULF干擾組H1299細(xì)胞總蛋白，使用BCATMprotein assay kit測(cè)定總蛋白濃度，取50μg蛋白進(jìn)行5%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂牛奶的TBST封閉PVDF膜，一抗室溫孵育1～2 h，用TBST緩沖液洗膜3次，每次5min，加入二抗室溫孵育1～2 h，用TBST緩沖液洗膜3次，每次5min。加入ECL底物孵育，顯影。

1.2.8 MTT檢測(cè)H1299細(xì)胞增殖情況：轉(zhuǎn)染48 h后，收集轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期H1299細(xì)胞，以5000個(gè)細(xì)胞／孔接種于96孔板，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的 Etoposide（6.25、12.5、25、50μmol／L）繼續(xù)培養(yǎng)48 h，進(jìn)行 MTT檢測(cè)。每孔加MTT 20μL（濃度為5mg／mL），放置孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入10%的SDS200μL，過(guò)夜。震蕩15min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（購(gòu)于美國(guó)Biorad公司）檢測(cè)570 nm處的吸光度值（A值）。細(xì)胞抑制率公式如下：抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組平均A值／對(duì)照組平均A值）×100%。

1.2.9 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期：收集各組細(xì)胞，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞的濃度為5×105～1×106個(gè)／L，取1 mL，細(xì)胞4℃離心10min，棄去上清液，冷PBS洗滌2次，加入4℃70%的冷乙醇固定24 h。加入50μg／mL碘化丙啶進(jìn)行細(xì)胞DNA染色，1 h內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），分析細(xì)胞DNA含量分布，計(jì)算出各個(gè)周期細(xì)胞的百分率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用t檢驗(yàn)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體的測(cè)序鑒定結(jié)果 慢病毒載體系統(tǒng)見圖1。挑取3個(gè)獨(dú)立克隆測(cè)序，結(jié)果表明合成的ULF shRNA寡核苷酸鏈序列插入正確，表明重組慢病毒載體構(gòu)建成功。

圖1 PLL3.7慢病毒載體示意圖Fig.1 Schematic diagram of PLL3.7 lentiviral vectors

2.2 重組慢病毒感染H1299細(xì)胞的感染效率慢病毒感染H1299細(xì)胞72 h后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：ULF-shRNA和shcontrol感染后均有80%以上的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，證明重組慢病毒感染成功（見圖2）。

圖2 感染72 h后細(xì)胞顯微成像（左）和熒光照片（右）（×200）Fig.2 Cellmicroscopic imaging（left）and fluorescence photograph（right）after transfected 72 h（×200）

2.3 Western blot檢測(cè)ULF蛋白水平表達(dá) Western blot結(jié)果顯示：感染ULF-shRNA病毒的H1299細(xì)胞，ULF蛋白表達(dá)水平明顯降低，ULF蛋白表達(dá)的干擾效率約60%～80%（見圖4）。

圖3 感染ULF-shRNA病毒的H1299細(xì)胞ULF蛋白表達(dá)*P＜0.05，與shCtr1組相比Fig.3 ULF protein levels in H1299 cell*P＜0.05，compared with shCtr1 group

2.4 H1299細(xì)胞凋亡的檢測(cè) ULF有效干擾組和對(duì)照組H1299細(xì)胞分別用20μg／mL etoposide處理24 h，之后加細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，抽提蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)。選擇檢測(cè)細(xì)胞凋亡的標(biāo)記物c-PARP來(lái)說(shuō)明細(xì)胞的凋亡程度，結(jié)果表明：ULF有效干擾組的H1299細(xì)胞凋亡程度顯著高于對(duì)照細(xì)胞（見圖4）。說(shuō)明沉默ULF基因可增加結(jié)腸癌細(xì)胞H1299對(duì)etoposide的敏感性，顯著增加etoposide誘導(dǎo)的結(jié)腸癌H1299細(xì)胞的凋亡。

圖4 2組H1299細(xì)胞c-PARP蛋白表達(dá)比較Fig.4 c-PARP protein levels in H1299 control cells and ULF Silence cells

2.5 MTT檢測(cè)H1299細(xì)胞增殖情況 MTT結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染慢病毒后，給予不同劑量etoposide處理，ULF干擾細(xì)胞組細(xì)胞增殖抑制率顯著高于對(duì)照組，并與etoposide劑量呈正相關(guān)，2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

表1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后依托泊甙對(duì)H1299細(xì)胞增殖的抑制率Tab.1 MTT assay cells transfected H1299 etoposide on cell proliferation rate

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 流式結(jié)果顯示有效干擾組G0／G1期細(xì)胞較對(duì)照組明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。M期細(xì)胞稍增加，2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表2）。表明細(xì)胞出現(xiàn)S期阻滯。

表2 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布情況（%）Tab.2 Cell cycle distribution byFlow cytometric analysis（%）

3 討論

泛素化和去泛素化與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，惡性腫瘤多伴隨癌基因和抑癌基因產(chǎn)物的表達(dá)異常。腫瘤可以起因于癌基因蛋白／生長(zhǎng)促進(jìn)因子的穩(wěn)定或由于腫瘤抑癌基因的不穩(wěn)定。一些正常通過(guò)蛋白酶體降解的癌基因蛋白，如果不能及時(shí)地從細(xì)胞中清除，就會(huì)引起細(xì)胞惡變［3］。去泛素化酶USP9X可通過(guò)其去泛素化活性參與多條信號(hào)通路。E3連接酶ULF可以降解腫瘤抑制因子p14ARF［8］，推測(cè)其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但目前有關(guān)肺癌中ULF的研究非常少。

RNAi技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的高效基因沉默技術(shù)，是指利用體外合成的短雙鏈RNA抑制細(xì)胞內(nèi)特定基因表達(dá)的技術(shù)，其本質(zhì)是利用siRNA與相應(yīng)的mRNA特異結(jié)合、降解，阻止mRNA的翻譯，從而使靶基因的表達(dá)失活，是一種簡(jiǎn)單高效的代替基因敲除的新興生物技術(shù)［9］。RNAi主要在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮效應(yīng)，無(wú)需克服核膜屏障，并且具有高效、特異阻斷靶基因表達(dá)的作用，在基因功能的研究及部分基因治療方面發(fā)揮了重要的作用［10-12］。慢病毒載體具有轉(zhuǎn)移基因片段容量大、感染效率高、不易引發(fā)宿主免疫反應(yīng)、轉(zhuǎn)基因可以持續(xù)而高效表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)［13-15］。本研究利用慢病毒載體介導(dǎo)的RNAi技術(shù)高效、特異敲除細(xì)胞內(nèi)靶基因ULF，探討能否通過(guò)導(dǎo)入U(xiǎn)LF特異性shRNA來(lái)下調(diào)肺癌細(xì)胞H1299內(nèi)的ULF表達(dá)水平從而抑制H1299細(xì)胞生長(zhǎng)。

本研究中采用慢病毒介導(dǎo)的靶向ULF的shRNA感染H1299細(xì)胞。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，感染ULF-shRNA病毒的H1299細(xì)胞ULF mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示：感染ULF-shRNA病毒的H1299細(xì)胞ULF蛋白水平顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.05）。此外，沉默ULF的H1299細(xì)胞在用etoposide處理后凋亡率顯著高于對(duì)照組，細(xì)胞增殖抑制率也顯著高于對(duì)照細(xì)胞組，并與etoposide劑量呈正相關(guān)，2組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。流式分析結(jié)果顯示：有效干擾組G0／G1期細(xì)胞較對(duì)照組明顯增加，S期細(xì)胞明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明靶向 ULF的 RNAi可阻斷 H1299細(xì)胞 ULF的表達(dá)，在etoposide處理后，促進(jìn)了H1299細(xì)胞的凋亡。

ULF基因的沉默能夠顯著的增加etoposide引起的H1299細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，使細(xì)胞出現(xiàn)S期阻滯，因此推測(cè)ULF基因可能成為癌癥基因治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。其確切機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，慢病毒載體介導(dǎo)的靶向ULF的shRNA能特異性沉默肺癌細(xì)胞H1299中ULFmRNA及蛋白的表達(dá)水平，從而促進(jìn)etoposide引起的肺癌細(xì)胞凋亡，為肺癌的基因治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（編校：吳莤）

Effect of ULF gene silence on etoposide induced H1299 cell apoptosis

LIUWei1，XU Xin2，CAO Xiao-ci3，YUAN Fei4，F(xiàn)ANG Hui-ying4

（1.School of Nursing，Hebei Medical College，Shijiazhuang 050000，China；2.Emergency Department，Hebei Provincial People's Hospital，Shijiazhuang 050000，China；3.Tumor Division，Hebei Provincial People's Hospital，Shijiazhuang 050000，China；4.Dental Department，Shandong Zaozhuang Vocational College，Zaozhuang 050000，China）

ObjectiveTo explore the effects of knocking down ULF gene on the apoptosis of non-small-cell carcinoma H1299 cell after treatment with etoposide.MethodsThree ULF small interfering RNA（siRNA）sequences and one negative control siRNA sequencewere designed and synthesized，and then individually transfected into H1299 cell via lentivirus.The interference efficiency of ULF-siRNA were screened by real-time PCR and Western blotting.Then themost target siRNA was used for apoptosis assay after treatmentwith etoposide，MTT assay for H1299 cell proliferation，flow cytometry for cell cycle distribution.ResultsThe expression of ULF gene and its protein ULF were down-regulated in H1299 cell when transfected with ULF-siRNA，and ULF-siRNA-1 was themost effective one，which had the highest inhibition rate（80%）of ULF expression.Compared with negative control group，ULF-siRNA group showed an obvious apoptosis after treatmentwith etoposide，and the inhibition rate ofwas higher than control group，which was positively correlated with etoposide dose，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Flow cytometry showed that compared with the control group，G0／G1 cell cycle in ULF-siRNA group was increased，and S phase cells was decreased，the differences were all statistically significant（P＜0.05）.ConclusionDown-regulation ULF protein expression through treatmentwith etoposide can induce apoptosis of non-small-cell carcinoma H1299 cells，and inhibit cell proliferation，which lead to cell cycle arrest.ULF genemay become the new target of gene therapy for cancer.

ULF gene；H1299 cells；lung cancer；etoposide

R318.04

A

1005－1678（2014）04－0059－04

惡性腫瘤細(xì)胞的重要特征之一是細(xì)胞凋亡的減少和細(xì)胞的無(wú)限增殖。近年來(lái)，蛋白的泛素化去泛素化在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用受到了人們的廣泛重視［1-3］。ULF（ubiqutin ligase forARF）原名為TRIP12（thyroid hormone receptor interacting protein 12），位于人類基因組第2號(hào)染色體長(zhǎng)臂的36區(qū)3帶（2q36.3）。1995年，TRIP12作為一系列與細(xì)胞核內(nèi)甲狀腺激素受體相互結(jié)合的蛋白質(zhì)中的一員而被發(fā)現(xiàn)［4］。2009年，TRIP12被鑒定具有E3泛素連接酶活性，參與人類細(xì)胞中泛素融合降解（ubiquitin fusion degradation，UFD）途徑［5-7］。2010年，Chen等在研究腫瘤抑制因子p14ARF的降解時(shí)，從ARF的結(jié)合蛋白NPM的復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)ULF可以與ARF結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ULF可以泛素化并降解ARF［8］。Etopside是一種廣譜的抗癌制劑，它針對(duì)腫瘤高度的分裂增殖能力，作用于處于活躍分裂周期中的細(xì)胞，抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性，引起DNA損傷并抑制組織損傷的修復(fù)，在臨床中被廣泛用于白血病、小細(xì)胞肺癌、惡性淋巴癌、卵巢癌等惡性腫瘤的化療。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)下調(diào)ULF蛋白在H1299細(xì)胞中的表達(dá)，檢測(cè)etopside處理后干擾組與對(duì)照組H1299細(xì)胞凋亡水平的變化，MTT法檢測(cè)H1299細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，旨在為以ULF基因?yàn)橹委煱悬c(diǎn)的基因治療提供理論依據(jù)。

劉偉，女，碩士，講師，研究方向：臨床腫瘤學(xué)，E-mail：273860690＠qq.com。