芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細胞輻射損傷的保護作用研究

路璐，張俊伶，李德冠，孟愛民

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所 天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室，天津 300192）

瀘州市12所非基層醫(yī)療機構(gòu)實施基本藥物制度的成效分析…………………………………………………… 江啟蓉，馮碧敏（184）

芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細胞輻射損傷的保護作用研究

路璐，張俊伶，李德冠，孟愛民

（中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院放射醫(yī)學研究所 天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室，天津 300192）

目的探討芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細胞輻射損傷的保護作用，進一步探討其可能的作用機制。方法經(jīng)免疫磁珠細胞分選法獲得小鼠骨髓c-kit陽性細胞，設(shè)空白對照組、單加藥組和照射劑量1 Gy、4 Gy的照射加藥組。后2組均加入終濃度為10－8～10－3mol／L的芝麻酚，照射加藥組在照射前30min加藥，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)18 h。采用生物發(fā)光法檢測小鼠骨髓c-kit陽性細胞的細胞活力，甲基纖維素半固體培養(yǎng)法檢測克隆形成能力，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平。結(jié)果與對照組比較，1 Gy和4 Gy射線照射后小鼠c-kit陽性細胞的細胞活力分別下降59.52%和79.35%（P＜0.05），集落形成數(shù)量分別下降40.38%和87.69%（P＜0.05）；在10－8～10－6mol／L濃度范圍內(nèi)，芝麻酚可顯著提高小鼠c-kit陽性細胞細胞活力和集落形成數(shù)量，但對細胞凋亡無影響。結(jié)論芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細胞輻射損傷的保護作用可能是通過提高造血祖細胞的增殖能力。

芝麻酚；c-kit陽性細胞；骨髓；輻射損傷；輻射防護；

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：C57BL／6小鼠50只，雄性，SPF級，8～10周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，合格證號：SCXK（京）2009-0017，由中國醫(yī)學科學院生物醫(yī)學工程研究所動物實驗中心提供，SPF級條件飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器：芝麻酚購自美國 Sigma公司；Celltiter-GloTM細胞活力檢測試劑盒購自美國Promega公司；甲基纖維素半固體培養(yǎng)基M3534購自加拿大Stem Cell Technologies公司；StemSpan Serum-Free Expansion Medium（SFEM）購自加拿大Stem Cell Technologies公司；FITC Annexin V／PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；CD117 Microbeads購自德國MiltenyBiotec公司。137Csγ-射線照射源，劑量率為 1.01 Gy／min（Autocell40，加拿大原子能有限公司）；多功能酶標儀（Infinite M200，瑞士）；流式細胞儀（美國BD Accuri C6）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠骨髓c-kit陽性細胞培養(yǎng)：富集小鼠脫頸處死，75%乙醇浸泡5min，無菌條件下取股、脛骨，用含2%胎牛血清的PBS沖洗骨髓細胞，用尼龍膜過濾后進行細胞計數(shù)；1500 r／min離心5 min，棄去上清后按照每109個細胞用200μL PBS懸起；按照每108個細胞加入20μL的CD117磁珠，冰上孵育15min；向細胞懸液中加入5 mL PBS，1 500 r／min離心 5min，洗滌1次；按照109細胞1mLPBS懸起細胞；LS柱子安裝到磁架上，加入3mL PBS，重力作用自然流盡潤柱。加入小鼠細胞懸液，過柱子后用3mL的PBS洗滌3次；將柱子從分離器上拿下，放到無菌管中，加入2mL PBS迅速吹打下所要細胞，再用1mL PBS吹打1次，離心、重懸、計數(shù)。

1.2.2 芝麻酚和輻射處理細胞：用無水乙醇溶解芝麻酚，使用帶有0.22μm濾膜的濾器過濾除菌。用SFEM培養(yǎng)基依次10倍稀釋芝麻酚溶液，分別稀釋成2×10－3、2×10－4、2×10－5、2×10－6、2×10－7、2×10－8mol／L。將細胞懸液調(diào)整到 1×106／mL的濃度，細胞懸液以每管1.8mL的量分配至8支5mL EP管當中，然后加入含有不同劑量藥物的SFEM培養(yǎng)基1.8mL使芝麻酚終濃度分別為 10－3、10－4、10－5、10－6、10－7、10－8mol／L，細胞終濃度為5×105個／mL。將細胞懸液接種至96孔板，每孔180μL，每組6個平行孔。37℃孵育30min后將種好的96孔板接受不同劑量137Csγ-射線（0Gy、1 Gy、4Gy）照射。

1.2.3 小鼠骨髓c-kit陽性細胞細胞活力的測定：用化學發(fā)光法進行細胞活力測定［11］。細胞在37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h后，將96孔板室溫放置30min，加入生物發(fā)光試劑Celltiter-GloTM20μL，振蕩2min后，轉(zhuǎn)入白色測定板室溫避光放置10min，用多功能酶標儀檢測發(fā)光信號，以相對熒光強度（relative light units，RLU）作為細胞活力單位。

1.2.4 小鼠骨髓c-kit陽性細胞凋亡水平檢測：根據(jù)1.2.2實驗結(jié)果選擇芝麻酚終濃度為 10－6、10－7、10－8mol／L的細胞，細胞終濃度為5×105個／mL，將細胞懸液種6孔板，每孔2mL，每組3個平行孔，加藥后在37℃CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30min進行137Csγ-射線（0 Gy、1 Gy、4 Gy）照射細胞，之后 37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h，吹打收集懸浮細胞至2 mL EP管內(nèi)，洗滌細胞，加入300μL Binding Buffer懸浮細胞；再加入5μL Annexin V-FITC混勻，室溫避光孵育15 min；上機前5 min加5μL PI染色，流式檢測。空白對照組同時設(shè)置陰性對照、Annexin V、PI單染組。

1.2.5 小鼠骨髓c-kit陽性細胞克隆形成能力檢測：用SFEM培養(yǎng)基調(diào)整c-kit＋細胞濃度為1×104個／mL（對照組）、2×104個／mL（1 Gy照射組）和 1×105個／mL（4 Gy照射組）［12-13］，加0.2mL稀釋好的細胞懸液至2mL甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，充分混勻后加入24孔板，每孔0.5mL，每組6個平行孔。輕搖培養(yǎng)板，使培養(yǎng)基均勻分布。將培養(yǎng)板放入濕盒，置入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)第7天在倒置顯微鏡下進行觀察。低倍觀察集落形成情況，細胞數(shù)≥50為陽性集落。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，正態(tài)計量資料用±s”表示，多組間比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細胞細胞活力的影響芝麻酚在濃度 10－8、10－7、10－6、10－5mol／L時能夠促進 c-kit＋細胞增殖，細胞活力分別為空白對照組（芝麻酚濃度0mol／L，細胞活力100%）細胞活力的109.8%、109.8%、107.8%和104.1%；但在10－4mol／L和 10－3mol／L時能明顯抑制 c-kit＋細胞增殖（P＜0.05，見圖1）。

圖1 不同濃度芝麻酚對骨髓c-kit＋細胞活力的影響*P＜0.05，與空白對照組相比Fig.1 Effects of different concentrations of sesamol on the viability of bonemarrow c-kit＋cells*P＜0.05，compared with blank control group

2.2 芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細胞輻射損傷的保護作用 與對照組比較，照射1Gy或4 Gy后骨髓細胞活力分別下降59.52%和79.35%，提示照射會導(dǎo)致造血系統(tǒng)骨髓c-kit＋細胞功能活力下降。與對照組比較，芝麻酚對照射后骨髓c-kit＋細胞活力有一定的保護作用：有效保護濃度在10－8～10－6mol／L，是細胞毒性劑量10－3的1／1 000～1／10 000（見表1）。

表1 不同濃度芝麻酚及1 Gy、4 Gy照射對骨髓c-kit＋細胞活力的影響Tab.1 Effects of different concentrations of sesamol and 1 Gy，4 Gy irradiation on the viability of bonemarrow c-kit＋cells

2.3 芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細胞細胞凋亡的影響輻射損傷保護作用結(jié)果顯示 10－8、10－7、10－6mol／L濃度芝麻酚能夠保護小鼠骨髓c-kit陽性細胞輻射損傷，因此以下實驗芝麻酚濃度均選用10－8、10－7、10－6mol／L。與對照組比較，1 Gy、4 Gy照射后18 h，小鼠骨髓c-kit陽性細胞早期和晚期凋亡率均顯著增加（P＜0.05），芝麻酚藥物組對骨髓c-kit陽性細胞細胞凋亡率沒有明顯作用（見圖2、表2）。

圖2 流式檢測小鼠骨髓c-kit陽性細胞細胞凋亡Fig.2 Representative image ofmice bonemarrow c-kit positive cells apoptosis by flow cytometry

表2 不同濃度芝麻酚對1 Gy、4 Gy照射骨髓c-kit＋細胞細胞凋亡的影響Tab.2 Effects of different concentrations of sesamol and 1 Gy，4 Gy irradiation on apoptosis of bonemarrow c-kit＋cells

2.4 芝麻酚對小鼠骨髓c-kit陽性細胞粒單系克隆形成能力的影響 1 Gy劑量照射組的集落形成數(shù)量較對照組下降40.38%（P＜0.05），4 Gy劑量照射組的集落形成數(shù)量較對照組下降87.69%（P＜0.05），表明本實驗構(gòu)建的輻射損傷模型是成功的。在1 Gy照射時，10－7mol／L芝麻酚組較照射組集落形成數(shù)量提高了29.03%（P＜0.05）；在4Gy照射時，10－7和10－6mol／L芝麻酚組較照射組集落形成數(shù)量分別提高了56.25%和40.00%，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，見圖 3）。

圖3 芝麻酚及照射對小鼠粒單系克隆形成能力的比較*P＜0.05，與空白對照組相比Fig.3 Comparison of the effects of sesamol and irradiation on mice CFU-GM*P＜0.05，compared with blank control group

3 討論

造血干細胞是存在于造血組織中的一群特殊細胞，具有自我更新以及分化生成造血系統(tǒng)中各類成熟血細胞的原始細胞的能力。自我更新能力的差異導(dǎo)致了造血干細胞（haematopoietic stem cells，HSCs）功能的異質(zhì)性，進而被分成3個不同亞群：長期造血干細胞（long term haematopoietic stem cells，LT-HSCs）、短期造血干細胞（short term haematopoietic stem cells，ST-HSCs）和多能祖細胞（multipotential predecessors，MPPs）［14］。造血系統(tǒng)是輻射損傷敏感靶器官，中低劑量射線照射易引起造血祖細胞損傷，進而導(dǎo)致急性骨髓抑制［15-16］。因此，造血系統(tǒng)中造血祖細胞對輻射較為敏感，有效的低毒性藥物能夠減輕輻射引起的造血祖細胞損傷。本研究旨在觀察芝麻酚對骨髓c-kit陽性細胞輻射損傷的體外保護作用，在正常骨髓中，約50%CD34＋祖細胞（包括定向的紅系、粒單系和巨核細胞系）表達c-kit（CD117）。c-kit表達被認為是骨髓造血干細胞較早分化階段的特征性標志［17］。故實驗選取骨髓c-kit＋細胞作為研究對象。實驗結(jié)果顯示：芝麻酚對 c-kit＋細胞毒性作用較小，在濃度為10－8～10－5mol／L時細胞活力水平變化不大，僅在濃度＞10－4mol／L時候有明顯的細胞毒性作用。

1Gy、4 Gy劑量照射前加入芝麻酚孵育30min，與未加芝麻酚組比較，細胞活力明顯增加，說明芝麻酚對小鼠骨髓c-kit＋細胞輻射損傷有一定保護作用。觀察到這一作用后，本研究繼續(xù)探討保護作用的可能機制。集落形成實驗是功能實驗，檢測骨髓造血祖細胞增殖能力，c-kit＋細胞集落形成能力的結(jié)果顯示，使用芝麻酚后c-kit＋細胞集落形成能力顯著增加，說明芝麻酚能夠有效提高造血祖細胞的增值能力，與本實驗室之前體內(nèi)研究結(jié)果一致［10］。射線照射會引起c-kit＋細胞發(fā)生細胞凋亡，但芝麻酚對細胞凋亡未見明顯的改善作用。

芝麻酚對小鼠骨髓c-kit＋細胞輻射損傷有一定的保護作用，其最直接的作用是提高骨髓c-kit＋細胞粒單系克隆形成能力。盡管芝麻酚對射線引起的細胞直接損傷沒有明顯的保護作用，但能夠減輕射線對祖細胞增殖的抑制作用，更深層次的作用機制還需進一步研究。

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（編校：吳茜）

Protective effects of sesamol on radiation injury mouse bonemarrow c-kit＋cell

LU Lu，ZHANG Jun-ling，LIDe-guan，MENG Ai-min

（Institute of Radiation Medicine，Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical Collage.
Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine，Tianjin 300192，China）

ObjectiveTo investigate the protective effect of sesamol on radiation injury mouse bone marrow c-kit＋cell，and further explore its possiblemechanism.MethodsMouse bonemarrow c-kit＋cellswere collected by immunomagnetic cellsortingmethod.Therewere2 groups in the study：single dosing group and radiation plus drug group（doses of irradiation included 1Gy and 4Gy），and 10－8～10－3mol／L sesamolwere co-cultured with mouse bonemarrow c-kit＋cell half hour before irradiation exposure，cells were then cultured for 18 hours under the conventional culture conditions（37℃ and 5%CO2）.The viability ofmouse bone marrow c-kit＋cells were measured by bioluminescence.The ability of colony-forming units were detected by CFU-GM and apoptotic rate of c-kit＋cellswere detected by Annexin V／PIantiapoptotic assay.ResultsCompared with control group，after 1Gy and 4Gy irradiated，cell viability ofmouse bonemarrow c-kit＋cellswere decreased 59.52%and 79.35%，respectively（P＜0.05），the number of colony-forming were decreased 40.38%and 87.69%，respectively（P＜0.05）.Cell viability of c-kit＋cells and the number of colonies formed were significantly increased with sesamol concentration between 10－8～10－6mol／L，butnot improve apoptosis rate.ConclusionSesamol has protective effect on irradiation-induced injury in mouse bonemarrow c-kit＋cells，themechanism ofwhichmay be related to the ability of hematopoietic progenitor cells proliferation.

sesamol；c-kit＋cell；bonemarrow；radiation injury；radiation protection

R551

A

1005－1678（2014）04－0001－04

造血細胞是一個增殖活躍的細胞群，當受到放射線損傷時，即會發(fā)生造血功能障礙，其主要原因之一是殺傷了維持造血功能的造血干／祖細胞［1-4］，機體造血主要依靠造血祖細胞來擴增［5］。c-kit是造血祖細胞表達干細胞因子的受體［6］。

芝麻酚（sesamol，SM）化學名稱為 3，4-亞甲二氧基苯酚，原由芝麻油提取分離而得，具有一定的損傷防護作用。研究發(fā)現(xiàn)，芝麻酚可有效降低受照小鼠外周血淋巴細胞DNA損傷［7］，通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥介質(zhì)改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝毒性［8］，提高60Coγ射線照射大鼠的抗氧化能力［9］，本實驗室先前研究結(jié)果顯示芝麻酚可以提高小鼠骨髓細胞粒單系克隆形成能力［10］。但芝麻酚在體外對造血細胞是否也有保護作用并不清楚。本文旨在探討芝麻酚對小鼠骨髓c-kit＋細胞輻射損傷后的影響。

國家自然科學基金資助項目（81372928）；協(xié)和青年基金和中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（3332013044）；中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所學科發(fā)展專項基金（1340）

路璐，女，碩士，助理研究員，研究方向：造血和免疫輻射損傷防治，E-mail：lulu＠irm-cams.ac.cn。