怡腎丸對阿霉素腎病大鼠腎臟TNF-α的影響

馮 立

武漢市中醫(yī)醫(yī)院，武漢 430014

腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種多效的炎癥性細(xì)胞因子，在腎臟疾病損傷中起關(guān)鍵作用，炎癥損傷是間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素。怡腎丸作為補(bǔ)腎泄?jié)岬拇矸絼?，被用于臨床治療慢性腎功能衰竭(chronic kidney dysfunction，CKD)3～5期的患者，有很好的療效。本研究通過對阿霉素腎病大鼠病變腎臟組織中TNF-α含量的測定，觀察怡腎丸對TNF-α的影響，探討其補(bǔ)腎泄?jié)岬臋C(jī)制，以及是否通過影響TNF-α來延緩腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展，保護(hù)腎臟功能，為怡腎丸的臨床療效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

健康SD雄性大鼠80只，體重(170±10) g，購自于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。每籠5只，大鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持恒溫、通風(fēng)、安靜，每日更換墊料，定期消毒籠具；給予12 h燈光照射管制；每只大鼠均給予嚴(yán)格的卡片登記管理。

1.2 藥物及試劑

怡腎丸由熟地15 g，生地10 g，白術(shù)10 g，五味子10 g，山茱萸15 g，人中黃5 g，砂仁5 g，蟬蛻5 g等組成，由本院藥學(xué)基地統(tǒng)一制備。參照《中國藥典》2010年版附錄ⅠC顆粒劑和國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的“中藥配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”中的備案標(biāo)準(zhǔn)，對配方顆粒的性狀、水分、溶化性、裝量差異、微生物限度等指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制。六味地黃丸購于湖南九芝堂股份有限公司(批號：CY1174)；注射用鹽酸多柔比星購于深圳萬樂藥業(yè)有限公司(批號：CY0027)。兔抗大鼠TNF-α試劑購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器

CS-Ⅵ型攤片烤片機(jī)、TS-12A生物組織自動脫水機(jī)、冷凍臺、BM-Ⅷ生物組織包埋機(jī)(湖北孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)；FINESSE325珊頓旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(英國產(chǎn)品)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG -9053(上海山連實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；OLYMPUS顯微鏡BX51(日本產(chǎn)品)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動物分組及處理 80只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，取60只造模，本研究采用一次性尾靜脈注射阿霉素6 mg/kg的方法復(fù)制阿霉素腎病大鼠模型。將模型復(fù)制成功的大鼠，隨機(jī)分為模型組、怡腎丸組、六味地黃丸組，每組20只。未做特殊處理的20只大鼠作為空白對照組。每隔7 d測1次體重，依據(jù)體重調(diào)整灌胃的藥量。各組處理如下：空白對照組與模型組均予以自由飲水、攝食，等體積蒸餾水灌胃，劑量參照怡腎丸組；怡腎丸組，60 kg體重的成人每日劑量為18 g，怡腎丸藥丸研碎后按照藥物劑量換算方法換算成大鼠的劑量溶于4 ml蒸餾水，每日上午灌胃1次；六味地黃丸組，60 kg體重的成人每日劑量為9 g，六味地黃丸藥丸研碎后按照藥物劑量換算方法換算成大鼠的劑量溶于4 ml蒸餾水，每日上午灌胃1次。各組的療程均為8周。

1.4.2 藥物劑量換算方法 公式為D1：D2=R1：R2，D2=D1×R2/R1。D1為成人的服藥劑量，是已知劑量；D2為大鼠服藥劑量，為所求劑量；R1以60 kg的成人服藥劑量為標(biāo)準(zhǔn)，即R1=346.68；R2為大鼠體表面積比值。

1.4.3 標(biāo)本采集和處理 分別于灌胃后第2、4、6、8周分離雙腎，稱重后將左腎沿腎門縱向切開，置于4%多聚甲醛固定，24～48 h后石蠟包埋，切片待用，采用免疫組織化學(xué)法觀察TNF-α的表達(dá)變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 動物死亡狀況

造模8周后，模型組大鼠死亡7只，怡腎丸組死亡2只，六味地黃丸組死亡3只。

2.2 TNF-α在腎間質(zhì)的表達(dá)與定量分析

2.2.1 TNF-α在腎間質(zhì)的表達(dá) TNF-α在空白組腎間質(zhì)輕度表達(dá)；在模型組的腎間質(zhì)表達(dá)明顯；在六味地黃丸組與怡腎丸組的腎間質(zhì)都有高度表達(dá)。見圖1。

A：空白組；B：模型組；C：六味地黃丸組；D：怡腎丸組圖1 各組腎間質(zhì)TNF-α的表達(dá)(免疫組織化學(xué)法，×400)

2.2.2 TNF-α的定量分析 組內(nèi)比較：空白組第2、4、6、8周4個時間點(diǎn)相互比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組、六味地黃丸組、怡腎丸組第2、4、6、8周4個時間點(diǎn)相互比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組間比較：造模后第2、4、6或8周，模型組、六味地黃丸組、怡腎丸組分別與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；六味地黃丸組及怡腎丸組與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；六味地黃丸組與怡腎丸組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明造模后六味地黃丸組與怡腎丸組療效無明顯差異。見表1、圖2。

表1 各組TNF-α累積光密度的定量分析(μm2，±s)

與空白組比較*P<0.05；與模型組比較△P<0.05

圖2 各組TNF-α累積光密度的定量變化圖

3 討論

在慢性腎臟病的進(jìn)展中，腎臟纖維化起著重要的作用，腎功能的惡化很大程度上取決于腎小管間質(zhì)纖維化的程度[1-4]。腎小管間質(zhì)細(xì)胞的活化、炎癥細(xì)胞浸潤、血管活性物質(zhì)等因素導(dǎo)致纖維化細(xì)胞因子過度表達(dá)，在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。

TNF-α是腎臟疾病發(fā)生發(fā)展中眾多細(xì)胞因子中關(guān)鍵的一個。TNF-α的毒性大，低濃度的TNF-α主要在局部發(fā)揮作用，高濃度的TNF-α可進(jìn)入血液中，引起全身性反應(yīng)。當(dāng)體內(nèi)發(fā)生炎癥時，TNF-α對單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等有趨化作用，并可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附分子-1(ELAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)等黏附分子，從而促進(jìn)循環(huán)中的單核、中性粒細(xì)胞等附著，并向感染和炎癥部位游走。另外，在參與炎癥反應(yīng)的眾多細(xì)胞因子中，TNF-α是早期細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)IL-1、IL-6和IL-10等其他細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌，且可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，誘導(dǎo)IL-1的合成，也可增加血小板激活因子(PAF)的合成，TNF-α還可誘導(dǎo)T細(xì)胞釋放干擾素γ，可調(diào)節(jié)β細(xì)胞的增生及分化。邱陽等[5]在實(shí)驗(yàn)中證明，模型組大鼠注射阿霉素后3 d，血清TNF-α水平開始出現(xiàn)輕度升高，血清TNF-α濃度與NF-kB p65活性變化呈正相關(guān)，提示NF-kB被激活后上調(diào)TNF-α的轉(zhuǎn)錄，使TNF-α生成增多。慢性腎功能衰竭發(fā)病機(jī)制大多與免疫機(jī)制有關(guān)，TNF-α是導(dǎo)致腎功能衰竭發(fā)生發(fā)展的重要炎癥介質(zhì)。許多研究[6-7]均表明，慢性腎功能衰竭患者TNF-α水平較正常對照組升高的原因可能是各種腎臟疾病導(dǎo)致的腎功能衰竭，都存在不同程度的炎癥反應(yīng)。單核細(xì)胞處于活化狀態(tài)，產(chǎn)生的TNF-α增加[8]。劉毅等[9]研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥非血液透析患者與血液透析患者外周血單核細(xì)胞中均有TNF-α的基因表達(dá)，由于免疫復(fù)合物、內(nèi)皮素、內(nèi)毒素等因素的刺激，改變內(nèi)皮細(xì)胞的黏附性及誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集于腎小球，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥因子，誘導(dǎo)腎小球局部也分泌TNF-α，腎功能下降致腎臟排泄障礙同樣致TNF-α升高。本實(shí)驗(yàn)表明，TNF-α的活性在阿霉素腎病模型組織中隨時間增加明顯增高，并伴有明顯間質(zhì)纖維化改變，提示：①TNF-α的活化與腎間質(zhì)纖維化有正相關(guān)；②阿霉素作為一個應(yīng)激因子，觸發(fā)了TNF-α信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步啟動下游的各種因子而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)蛋白的合成。

中醫(yī)沒有腎間質(zhì)纖維化的概念，但腎間質(zhì)纖維化最終可因久病傷正而導(dǎo)致正虛邪實(shí)，濁邪內(nèi)蘊(yùn)而出現(xiàn)的水腫、少尿、無尿、尿血、尿濁、腰痛、惡心、嘔吐等臨床表現(xiàn)，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中腎間質(zhì)纖維化的病理改變出現(xiàn)最終導(dǎo)致慢性腎功能不全所出現(xiàn)的疾病進(jìn)程相一致。但腎間質(zhì)纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚和成纖維細(xì)胞的增殖為病理特點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，“虛、痰(濁)、瘀、毒”四大病機(jī)學(xué)說實(shí)質(zhì)上是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。虛者，既有腎臟之虧虛，也有脾胃之不足；濁者，既有內(nèi)蘊(yùn)之痰濁，又有瘀血等邪毒。腎主藏精，為先天之本，“精氣奪則虛”，故腎虛的本質(zhì)是指腎中精氣之不足。腎臟本為排毒之臟器，腎氣虧虛，氣血運(yùn)行不暢，可使體內(nèi)代謝產(chǎn)物不能充分排出，瘀久則成濁毒。腎虛貫穿于整個慢性腎臟病的病程中，腎虛為本病發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)，也是治療的核心所在[10]。

怡腎丸基本方出自金代醫(yī)家張?jiān)氐摹恫C(jī)氣宜保命集》所記載的黑地黃丸，取其補(bǔ)腎泄?jié)?、攻補(bǔ)兼施之效，用于臨床可明顯改善患者臨床癥狀，延緩腎衰竭。其主要藥物包括熟地15 g，人中黃5 g，生地10 g，白術(shù)10 g，砂仁5 g，山茱萸15 g，五味子10 g，蟬蛻5 g。君藥為熟地和人中黃，熟地有補(bǔ)血滋陰，益精填髓之功；人中黃具有清熱解毒瀉濁之功，二藥合用，共奏補(bǔ)腎泄?jié)嶂?；臣藥為生地和山茱萸，生地補(bǔ)腎之精血，退浮熱之虛熱；山茱萸有補(bǔ)益肝腎，澀精固脫之效；五味子澀精滋腎；白術(shù)、砂仁為輕靈之品，共奏益氣健脾補(bǔ)腎之功，使其振奮先后天之氣，使補(bǔ)而不滯，且無留邪之弊，共為佐藥；蟬蛻具散風(fēng)除熱、利咽透疹、退翳、解痙之功，因其體氣輕揚(yáng)之性，使脾之氣易于外清，令肺之氣易于外達(dá)，脾、肺之氣升達(dá)于上、外，既有利于余邪的祛除，又有利于臟腑功能的恢復(fù)，故為使藥。

六味地黃丸是治療慢性腎臟病臨床上研究很多的方劑，有大量的臨床研究證明其對腎小球腎炎和腎病有明顯的治療作用，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，加速自由基及其代謝產(chǎn)物的消除，減輕體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，加強(qiáng)受損組織的修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)顯示，怡腎丸組及六味地黃丸組腎小管上皮細(xì)胞TNF-α的表達(dá)明顯低于模型組，證明怡腎丸對慢性腎臟病有明顯的治療作用。

怡腎丸用于臨床，針對慢性腎功能不全，肌酐升高，“濁毒內(nèi)蘊(yùn)”，能更好地從“泄?jié)帷钡慕嵌雀纳颇I功能。怡腎丸可能通過抑制TNF-α的表達(dá)，抑制腎小球的擴(kuò)大，減輕炎癥反應(yīng)和纖維化程度，明顯抑制腎小管上皮變性、壞死、脫落，從而達(dá)到保護(hù)腎單位，保護(hù)腎臟、延緩腎間質(zhì)纖維化的作用。

[1] NEILSON EG.Mechanisms of disease fibroblasts a new look at an old problem[J].Nat Clin Pract Nephrol，2006，2(2)：101-108.

[2] LIU Y.Renal fibrosis：new insights into the pathogenesis and theraeutics[J].Kidney Int，2006，69(2)：213-217.

[3] EDDY AA.Progression in chronic kidney disease[J].Adv Chronic Kidney Dis，2005，12(4)：353-365.Review.

[4] 王海燕.腎臟病學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：1146-1175.

[5] 邱陽，楊玉秀，任青，等.大黃素對慢性腎功能衰竭患者腫瘤壞死因子產(chǎn)生的抑制作用[J].中華腎臟病學(xué)雜志，1998，14(3)：188-189.

[6] 程曉霞，王軍.黃芪注射液對慢性腎衰患者血細(xì)胞因子的影響[J].中國中醫(yī)藥科技，2001，8(3)：178.

[7] 陳莉芬，李榮亨，曹文富，等.黃芪對慢性腎炎患者血清TNF-α、IL-6及細(xì)胞免疫功能的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2002，27(2)：174-176.

[8] 鐘巧，易著文.川芎嗪對小兒腎病綜合征腫瘤壞死因子的影響[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1997，17(2)：18-19.

[9] 劉毅，馬威，吳文莉，等.堅(jiān)腎合劑對Adenine所致CRF大鼠血NO、NOS、及TNF-α的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，2000，6(1)：28-30.

[10]邱陽，楊玉秀，任青，等.慢性腎衰患者外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子的觀察[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1996，25(5)：499-501.