IL-6對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 VCAM-1表達(dá)的影響*

徐 蘊(yùn) 竇珊珊 柳新平 崔利德 徐旭東

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，山東 濟(jì)寧 272067)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)因具有來(lái)源廣泛，易于分離培養(yǎng)，且不受倫理制約等優(yōu)勢(shì)，使其成為細(xì)胞替代治療的理想種子細(xì)胞[1-2]。然而骨髓MSCs移植后能在局部存留并分化的細(xì)胞量很少，不能滿(mǎn)足需要，從而難以達(dá)到理想治療效果。因此該療法詳細(xì)機(jī)制的闡明將為組織再生治療開(kāi)辟新的前景。 Caplan等[3]認(rèn)為，骨髓MSCS是存在于機(jī)體的一種多能干細(xì)胞，損傷組織釋放的炎癥因子可能與其從骨髓到達(dá)損傷組織完成修復(fù)作用有關(guān)。研究[4]表明炎性因子可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞與骨髓MSCs間的黏附，但機(jī)制有待進(jìn)一步證明。本實(shí)驗(yàn)著重觀(guān)察炎性因子IL-6對(duì)大鼠骨髓MSCs表達(dá)VCAM-1的影響，為全面闡明骨髓MSCs移植治療機(jī)制提供一份資料，同時(shí)對(duì)提高其臨床應(yīng)用療效打下理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Wistar大鼠；L-DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司); 胎牛血清(Hyclone公司); 青霉素和鏈霉素(華北制藥廠(chǎng)); 胰酶(Gibco公司); IL-6 (Peprotech公司)；免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒 (博士得生物工程公司); PE標(biāo)記抗大鼠VCAM-1單克隆抗體(BioLegend公司); Biozol總RNA提取試劑 (BioFlu公司); RT試劑盒K1622(Fermentas公司)，包括反轉(zhuǎn)錄酶、RNA抑制酶、Buffer、4種dNTP及Oligo引物等; DNA MarkerⅡ和Taq PCR MasterMix(天為時(shí)代有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取150 g左右的Wistar大鼠，處死，取兩側(cè)股骨，收集骨髓，離心，用含10%FBS的L-DMEM完全培養(yǎng)基重懸，以0.5×107/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中;置37℃、5% CO2及飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。3 d后首次更換培養(yǎng)基，去除未黏附細(xì)胞，以后每3～4 d換液1次。待細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合，用0.25%的胰蛋白酶消化，按1:3傳代。取第3代rMSCs用作試驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 取生長(zhǎng)2 d的第3代rMSCs，棄舊培養(yǎng)基，用0.1 mol PBS(pH7.2～7.4)洗2遍，加入不含血清的L-DMEM培基; 然后分成2組，每組6個(gè)樣本，一組加入IL-6使終濃度為10 ng/ml，另一組不加IL-6，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，分別收集各組細(xì)胞進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)顯色 收集各組細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定，按二步免疫組織化學(xué)法進(jìn)行rMSCs表面細(xì)胞黏附分子VCAM-1染色；用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。細(xì)胞被染成褐色或棕褐色為陽(yáng)性。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)VCAM-1的表達(dá)率 收集處理后的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為106/ml，體系為100 μl；分別加入1.25 μl PE標(biāo)記的VCAM-1(CD106) 單克隆抗體，室溫下避光孵育20 min，0.1 mol PBS洗2遍，1%多聚甲醛固定，待機(jī)檢測(cè)。以流式細(xì)胞儀配套軟件Cell Quest(Version 1.0)分析樣本中1×104個(gè)細(xì)胞相應(yīng)標(biāo)記陽(yáng)性表達(dá)率，用PE標(biāo)記同型IgG作相應(yīng)的免疫陰性對(duì)照。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)VCAM-1 mRNA的表達(dá) 用Bizol提取處理后的各組細(xì)胞總RNA。采用二步法進(jìn)行RT-PCR：第一步按Fermentas公司Firststrand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄制備各組cDNA；第二步分別用獲得的各組cDNA作模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。各基因引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，合成序列為：1)β-actin 上游引物: 5′-TGTCTAGGGGCTCTTCCA′-3; 下游引物: 5′-TGCTCGCTGTTTCACCTATG′-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為305bp。2)VCAM-1 上游引物: 5′-TGCACGGTCCCTAATGTGTA′-3，下游引物: 5′-CCCGT TCTTTAGGTGTCTGC′-3，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為350bp。擴(kuò)增條件為：94℃ 5 min預(yù)變性，94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。內(nèi)參β-actin的擴(kuò)增條件為：94℃ 3 min預(yù)變性，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物電泳凝膠置于UVP凝膠成像系統(tǒng)中掃描并進(jìn)行圖像分析，以VCAM-1光密度值與β-Actin光密度值作比，該比值即表示VCAM-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)顯色

免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，未刺激組rMSCs著色淺，說(shuō)明VCAM-1呈弱陽(yáng)性表達(dá)(圖1)，刺激組rMSCs著色深，說(shuō)明VCAM-1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。

圖1 未刺激組：rMSCs(400×)

圖2 刺激組:第3代rMSCs，VCAM-1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá) (400×)

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩組VCAM-1表達(dá)率

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，對(duì)照組VCAM-1的平均表達(dá)率僅為14.1%(圖3)，刺激組VCAM-1的平均表達(dá)率高達(dá)80.9%(圖4)，明顯高于對(duì)照組(P<0.001)；說(shuō)明IL-6可誘導(dǎo)rMSCs高表達(dá)VCAM-1。

圖3 對(duì)照組VCAM-1的表達(dá)率

圖4 IL-6刺激12 h后VCAM-1的表達(dá)率(B1)

2.3 兩組VCAM-1 mRNA的表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)顯示，刺激組：rMSCs VCAM-1的電泳條帶明顯較對(duì)照組亮(P<0.001)(圖5)；表明IL-6可誘導(dǎo)MSCs高表達(dá)VCAM-1。VCAM-1 mRNA的擴(kuò)增產(chǎn)物為350bp，內(nèi)參的大小為305bp。

1.Marker；2.刺激組VCAM-1 mRNA；3.對(duì)照組VCAM-1 mRNA；4.內(nèi)參

圖5 VCAM-1 mRNA的表達(dá)

3 討論

隨著對(duì)骨髓MSCs生物學(xué)特性等研究的深入，以及細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)、組織工程技術(shù)和基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，骨髓MSCs替代治療已成為近年來(lái)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域乃至整個(gè)生命科學(xué)領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)，為人類(lèi)征服多種疾病帶來(lái)了新的希望。目前，關(guān)于骨髓MSCs移植治療各種疾病的研究常見(jiàn)報(bào)道，然而其長(zhǎng)期治療效果卻不盡人意。因此，如何使骨髓MSCs在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)治療的靶向性和高效性成為目前該領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞有向缺血或損傷組織“歸巢”的特征。缺血性疾病如心肌梗死或缺血性再灌注情況下，損傷組織會(huì)釋放一系列的炎癥因子如IL-6以及趨化因子MCP-l等，刺激局部組織細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1等黏附分子，繼而啟動(dòng)白細(xì)胞的黏附、趨化過(guò)程[5]。骨髓MSCs的移植也可能同樣涉及MSCs的黏附、趨化作用，但目前這方面的研究尚待深入。

VCAM-1 屬于免疫球蛋白超家族成員，是組織中分布最廣的黏附分子之一。目前有關(guān)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)黏附分子表達(dá)的研究相對(duì)多一些，認(rèn)為VCAM-1是介導(dǎo)hMSCs向缺血或損傷組織遷移的重要黏附分子之一[6]；而有關(guān)鼠類(lèi)骨髓MSCs黏附分子表達(dá)的研究資料甚少，且結(jié)論有所差異[7]。Ruster B等[8]研究結(jié)果顯示VCAM-1可能在 MSCs黏附、遷移等過(guò)程起著非常重要的作用；Ren G等[9]認(rèn)為VCAM-I和ICAM-1在免疫反應(yīng)中也起到關(guān)鍵作用；Lu HH等[10]研究表明炎癥因子能使內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子如VCAM-1 表達(dá)增高。為此，我們采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞技術(shù)和RT-PCR技術(shù)從蛋白和基因水平研究了VCAM-1在rMSCs上的表達(dá)及IL-6對(duì)其表達(dá)的影響。結(jié)果表明：在生理狀態(tài)下，VCAM-1在 rMSCs上表達(dá)微弱；在體外，IL-6能誘導(dǎo) rMSCs高表達(dá) VCAM-1。這為證實(shí)VCAM-1參與在 MSCs的黏附、遷移等過(guò)程提供更充分的證據(jù)，并為進(jìn)一步研究MSC移植治療奠定了理論基礎(chǔ)。至于是否可通過(guò)提高M(jìn)SC，黏附分子表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)骨髓MSC治療的靶向性和高效性，還需作進(jìn)一步的試驗(yàn)研究。

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