厄貝沙坦對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化干預(yù)作用

劉中柱，潘明陽，劉艷姝，史為伍，牛效清

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154003)

腎間質(zhì)纖維化的過程包括腎小管的損傷、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的過多沉積、多個細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過程。TGF-β1致纖維化作用較強，故TGF-β1是預(yù)防、治療腎間質(zhì)纖維化目標(biāo)性因子。最近，結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和骨形成蛋白-7(bonemorphogenetic protein-7，BMP-7)作為 TGF-β1致纖維化的重要調(diào)節(jié)因子而出現(xiàn)。厄貝沙坦目前已廣泛用于臨床，并起到保護腎功和降低尿蛋白的功效。本實驗通過結(jié)扎大鼠單側(cè)輸尿管建立UUO模型，觀察大鼠腎臟的病理變化，免疫組化法檢測CTGF和BMP-7的表達，探討厄貝沙坦的藥物作用。

1 材料方法

1.1 主要材料

厄貝沙坦片(賽諾菲(杭州)制藥有限公司)；兔抗大鼠CTGF多克隆抗體(武漢博士德公司)；兔抗大鼠BMP-7多克隆抗體(武漢博士德公司)；SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)；多聚賴氨酸(武漢博士德公司)；CX41RF型高級顯微鏡(日本Olympus公司)；切片機(英國姍頓公司)；病理圖文彩色分析系統(tǒng)(同濟千屏影像公司)。

1.2 實驗動物分組

雄性Wistar大鼠36只，體重(200±20)g。建立模型：腹部常規(guī)碘伏消毒，10%水合氯醛0.4mL/100g經(jīng)腹腔注射麻醉，麻醉后左側(cè)背部剪毛，碘伏消毒，于左側(cè)背部肋弓處下方0.5cm處切開腹腔，暴露并分離左側(cè)輸尿管，結(jié)扎腎盂出口處及輸尿管上段輸尿管，并在結(jié)扎中點處離斷輸尿管，逐層縫合筋膜、肌肉、皮膚。假手術(shù)組僅分離不結(jié)扎左側(cè)輸尿管。治療組給予厄貝沙坦20mg/kg·d，每日一次。假手術(shù)組、模型組每天給予相同劑量的生理鹽水。

1.3 標(biāo)本收集

分別于造模成功后14d和28d，各組分別處死6只大鼠，迅速取出左腎，去包膜固定于10%的中性甲醛中，石蠟包埋并編號，切片機將蠟塊切成3μm切片，分別留取HE、MASSON染色和免疫組化標(biāo)本。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示。任意兩組比較方差齊時采用SNK(Student-Newman-Keuls)檢驗，方差不齊時采用Wilcoxon秩和檢驗(Wilcoxon rank sum test)。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

假手術(shù)組僅有少量CTGF表達，但BMP-7相對表達較多，且在處表達較高。模型組中CTGF表達較多，且在處表達較高，BMP-7相對表達較少。厄貝沙坦治療組與模型組比較，CTGF表達較低，而BMP-7表達較高。

表1 CTGF在大鼠腎間質(zhì)陽性面積表達百分比結(jié)果(%，x± s，n=6)

表2 BMP-7在大鼠腎間質(zhì)陽性面積表達百分比結(jié)果(%，x± s，n=6)

2.2 HE、MASSON染色結(jié)果

表3 HE染色陽性面積百分比結(jié)果(%，x± s，n=6)

表4 MASSON染色陽性面積百分比結(jié)果(%，x± s，n=6)

3 討論

目前，細(xì)胞因子參與腎間質(zhì)纖維化已受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。其中，CTGF是促腎間質(zhì)纖維化的重要因子。有研究證實CTGF不但能誘導(dǎo)TGF-β1生成，而且可增強TGF-β1的生物學(xué)活動［1，2］。CTGF 能增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成［1］。因此降低CTGF的表達，可減緩腎間質(zhì)纖維化的進程。BMP-7高度表達于腎臟，參與組織修復(fù)和生長，并會對抗腎間質(zhì)纖維化。在單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)、腎盂腎炎、慢性移植物腎臟病等動物實驗中，BMP-7mRNA及其蛋白表達均下調(diào)［3～5］。在培養(yǎng)的系膜細(xì)胞和足細(xì)胞中，BMP-7能抑制由TGF-β1、醛固酮、高糖等引起的負(fù)作用［6～8］。在 BMP-7 對腎小管上皮細(xì)胞作用的研究中，BMP-7被證實能抑制TGF-β1的生成，降低促炎癥因子基因和趨化因子的表達，并能抑制由多發(fā)性骨髓瘤誘導(dǎo)的EMT［9～11］。因此，增加BMP-7的表達能起到保護腎臟的作用。

作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotension system，RAS)的主要效應(yīng)器，血管緊張素 II(angiotensionII，Ang II)主要在出球小動脈發(fā)揮收縮功能，進而增加腎小球內(nèi)液壓。而腎小球內(nèi)壓力的增加可造成和加重腎損害［12］。厄貝沙坦能阻斷AT1受體和Ang II結(jié)合，降低腎小球內(nèi)液壓，從而發(fā)揮保護作用。Zhao等［13］在5/6大鼠腎臟切除模型中，發(fā)現(xiàn)厄貝沙坦治療組TGF-β1、smad2、AT1R表達下調(diào)，而smad6表達上調(diào)，進而發(fā)揮治療腎功不全的作用。Dai等［14］在對糖尿病腎病大鼠實驗中，認(rèn)為厄貝沙坦能抑制整合素連接激酶(Integrin-linked kinase，ILK)的過度表達，并能保護足細(xì)胞數(shù)量，從而預(yù)防疾病進展。

本實驗通過免疫組化觀察CTGF的表達結(jié)果，發(fā)現(xiàn)治療組的表達低于模型組，而檢測BMP-7的表達，發(fā)現(xiàn)治療組BMP-7的表達高于模型組。病理結(jié)果得出治療組腎間質(zhì)纖維化程度低于模型組。以上結(jié)果說明厄貝沙坦可通過下調(diào)CTGF的表達和上調(diào)BMP-7的表達，從而起到保護腎臟的作用。由于腎間質(zhì)纖維化是一個多因子參與的復(fù)雜過程，厄貝沙坦保護腎臟的藥物作用，目前尚需要進一步的臨床和基礎(chǔ)實驗研究。

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