血漿和支氣管肺泡灌洗液中脂連素和TXB2、6-keto-PGF1α水平與急性肺損傷關(guān)系的研究

孫玉花，李來傳，史有奎，臧全玲，陳京霞，李 鳳，張秀文

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊261031；2.濰坊醫(yī)學(xué)附屬醫(yī)院急診科，山東 濰坊261031）

急性肺損傷是一種常見危重急癥，每年的發(fā)病率一直穩(wěn)步上升。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)我國(guó)每年大約有1 200 000人患病，且醫(yī)院病死率約40%～60%［1］。ALI的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為可能與炎癥細(xì)胞（中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞等）被激活以及內(nèi)皮細(xì)胞受損而導(dǎo)致大量炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子生成和釋放有關(guān)。脂連素（APN）是近年來發(fā)現(xiàn)的主要由脂肪細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，盡管APN最初被描述為胰島素增敏劑，最近的研究已定義有多效性抗炎和血管保護(hù)作用［2，3］，且早有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道低脂連素血癥可增加ALI發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。此外，在小鼠的實(shí)驗(yàn)研究表明，APN有助于肺的免疫穩(wěn)態(tài)［4］。根據(jù)APN的免疫和血管保護(hù)特性，其理論上可能用于治療ALI。國(guó)內(nèi)對(duì)于APN是否參與ALI發(fā)生發(fā)展過程的研究尚少，本研究通過測(cè)定正常對(duì)照組和ALI組大鼠的血漿和支氣管肺泡灌洗液（BALF）在不同觀察時(shí)期的APN水平的變化情況，觀察其與ALI的關(guān)系，并對(duì)APN水平與ALI的程度是否存在相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠共45只，購(gòu)于濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于干凈、適溫的實(shí)驗(yàn)室，正常飲食，并避免發(fā)生肺部感染。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

LPS：E.coli內(nèi)毒素；氟烷；1%戊巴比妥。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理：將45只大鼠隨機(jī)分成生理鹽水對(duì)照組（9只）與實(shí)驗(yàn)組（36只）。用氟烷將大鼠麻醉并固定于操作臺(tái)。用簡(jiǎn)易霧化器給予實(shí)驗(yàn)組氣管內(nèi)霧化吸入LPS 0.5m L／kg（用生理鹽水配制LPS200μg／m L），對(duì)照組氣管內(nèi)霧化吸入生理鹽水0.5m L／kg。然后將處理后的36只實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物再隨機(jī)分成4組，每組9只進(jìn)行觀測(cè)，LPS給予后觀察4h為4h組，觀察12h為12h組，觀察24h為24h組，觀察48h為48h組。對(duì)照組觀察24h。

1.2.2 觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和采集標(biāo)本：在大鼠觀察完畢時(shí)，給予各大鼠50mg／kg的1%戊巴比妥鈉行腹腔麻醉。然后，暴露氣管并開胸，觀察肺形態(tài)。采集心臟血后，在左心耳開一約2mm切口，右室插入套管針，并于右室灌注肝素生理鹽水沖洗肺血管床直至肺組織潔白。將左主支氣管結(jié)扎后取左下肺組織（約1cm×1cm×0.5cm）用4%多聚甲醛浸泡固定24h，常規(guī)脫水、包埋、制成蠟塊后用HE染色，用于光鏡下觀察。余下的左肺組織稱濕重（W）后置60℃溫箱，7d后稱干重（D），求得濕重／干重比（W／D）。

1.2.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）留取及細(xì)胞計(jì)數(shù)：右肺用磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗8次，每次2.5m L，回收灌洗液。用單層紗布濾去黏液后取濾液10m L以3500rpm離心10min，吸取上清液保存于-20℃冰箱中待測(cè)細(xì)胞因子的含量及總蛋白的含量，離心后沉渣用于白細(xì)胞計(jì)數(shù)和中性粒細(xì)胞百分比的測(cè)定。

1.2.4 血漿和BALF中APN、TXB2、6-keto-PGF1α含量的測(cè)定：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附（ABC-ELISA）法分別檢測(cè)各樣本APN、TXB2、6-keto-PGF1α的含量水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)均以（）表示。組間差異采用單因素方差分析，SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異顯著。相關(guān)性分析采用直線相關(guān)回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的體征指標(biāo)

在觀察時(shí)間內(nèi)所有大鼠均存活。各組大鼠呼吸頻率的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺濕／干重表明，4～12h組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），24～48h組與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類及白蛋白含量

LPS給予后4～48h的各實(shí)驗(yàn)組BALF中性粒細(xì)胞數(shù)及白蛋白含量與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。見表1。

表1 ALI大鼠不同時(shí)相濕／干重、BALF細(xì)胞總分?jǐn)?shù)及白蛋白含量（，n=9）

表1 ALI大鼠不同時(shí)相濕／干重、BALF細(xì)胞總分?jǐn)?shù)及白蛋白含量（，n=9）

注：符號(hào)相同組間無差異，P＞0.05；符號(hào)不同（＃、＊）組間有差異，P＜0.05。

組別 濕／干重 白蛋白（g／L） 細(xì)胞總數(shù)×106 巨噬細(xì)胞% 中性粒細(xì)胞% 淋巴細(xì)胞%.3 13.6±3.3 4h組 6.73±0.68＊ 0.53±0.16＊ 18.9±0.6＊ 6.3±1.2＊ 89.6±7.3＊ 4.1±1.4＊12h組 6.50±0.59＊ 0.59±0.15＊ 19.0±1.3＊ 6.8±3.2＊ 87.9±6.9＊ 5.6±2.5＊24h組 4.80±0.58 0.37±0.12＃ 17.8±1.4＊ 7.1±3.8＊ 88.3±10.7＊ 4.7±1.8＊48h組 4.70±0.75 0.31±0.05＃ 16.9±0.9 28.5±2.7＃ 64.2±8.2＃ 6.2±1.9對(duì)照組 4.48±0.37 0.15±0.03 14.1±1.2 79.2±4.2 7.3±2＃

2.3 肺組織病理改變

2.3.1 NS對(duì)照組：光鏡下肺泡結(jié)構(gòu)完整，無紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞滲出（見圖1）。

圖1 對(duì)照組

2.3.2 4h組：大體觀察可見肺組織腫脹，包膜光亮，約半數(shù)可見出血點(diǎn)。光鏡（見圖2）肺泡腔內(nèi)有明顯的中性粒細(xì)胞呈灶狀浸潤(rùn)及紅細(xì)胞少量滲出；肺泡壁彌漫性輕度水腫、增厚且肺間質(zhì)輕度水腫，紅細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；還可見不規(guī)則形的毛細(xì)血管擴(kuò)張。

圖2 4h組

2.3.3 12h組：大體與4 h組外觀相似，光鏡下（見圖3）較4h組肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞滲出明顯，纖維蛋白滲出幾乎充滿管腔，中性粒細(xì)胞大面積滲出，肺泡間隔明顯增寬。

圖3 12h組

2.3.4 24～48h組：大體觀察可見肺組織略發(fā)黃，但無出血點(diǎn)。光鏡（見圖4）見肺泡腔內(nèi)有泡質(zhì)碎片，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少；肺泡腔擴(kuò)大且肺泡壁薄厚不均；肺泡間質(zhì)及成纖維細(xì)胞增生并有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。毛細(xì)血管擴(kuò)張少見，形態(tài)不規(guī)則。

圖4 24～48h組

2.4 血漿和BALF中APN和TXB2、6-keto-PGF1α水平的變化

實(shí)驗(yàn)組中4h、12h組血漿和BALF中APN、6-keto-PGF1α水平低于正常對(duì)照組，且血漿中APN差異更顯著（P＜0.01）；4h、12h組血漿和BALF中TXB2水平高于正常對(duì)照組 （P＜0.05）；24h、48h組中APN、TXB2及6-keto-PGF1α水平與對(duì)照組無差異（P＞0.05）。見表2。

表2 ALI大鼠不同時(shí)相血漿和BALF中APN和TXB2、6-keto-PGF1α含量及肺損傷評(píng)分（，n=9）

表2 ALI大鼠不同時(shí)相血漿和BALF中APN和TXB2、6-keto-PGF1α含量及肺損傷評(píng)分（，n=9）

注：符號(hào)相同組間無差異，P＞0.05；符號(hào)不同（＾、＊）組間有差異，P＜0.05，＃ 組與對(duì)照組相比差異顯著，P＜0.01。

組別 肺損傷評(píng)分Serm APN（ng／m L） TXB2（ng／L）6-keto-PGF1α（ng／L）BALF APN（ng／m L） TXB2（ng／L）6-keto-PGF1α（ng／L）對(duì)照組 0.8±0.8 16.9±2.0 127.6±48.5 94.2±18.9 1.7±0.1 131.7±36.5 99.2±16.2 4h組 8.4±1.8 9.5±1.9＊＃ 187.7±61.2＊ 82.4±15.4 1.5±0.2 216.6±45.1＊＃ 88.8±14.6 12h組 11.6±1.9 8.3±1.2＊＃ 259.1±32.6＊＃ 80.9±10.3 1.4±0.2＊ 338.5±33.2＊＃ 85.7±10.2 24h組 3.9±2.0 15.1±1.8＾ 143.4±62.1＾ 85.1±11.9 1.5±0.3 147.3±49.2 90.1±11.9 48h組 4.9±2.4 15.2±1.2＾ 139.3±38.2＾88.4±14.8 1.6±0.3 145.3±21.5 93.4±14.5

2.5 相關(guān)性分析

BALF中APN水平與ALI評(píng)分不存在直接相關(guān)性，血漿中APN水平與ALI評(píng)分存在較高的負(fù)相關(guān)（r=0.936，r2=0.877，P＜0.01）。

3 討論

ALI的發(fā)生發(fā)展機(jī)制非常復(fù)雜，目前認(rèn)為ALI是多種炎癥介質(zhì)相互作用的結(jié)果，且細(xì)胞因子之間相互聯(lián)系、相互影響形成復(fù)雜的促炎介質(zhì)及抗炎介質(zhì)系統(tǒng)，兩大炎癥系統(tǒng)的相互作用形成更為復(fù)雜的“細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”，當(dāng)打破兩大系統(tǒng)之間的平衡，則發(fā)生炎癥介質(zhì)失控性釋放，導(dǎo)致ALI甚至多器官功能障礙綜合征。

ALI時(shí)，創(chuàng)傷、感染等因素刺激血循環(huán)中出現(xiàn)高水平的β-腎上腺能激動(dòng)劑、LPS、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，β-腎上腺能激動(dòng)劑可抑制脂肪細(xì)胞中APN的mRNA水平且LPS、TNF-α能直接抑制脂肪細(xì)胞中APN mRNA的表達(dá)等，均可抑制APN分泌。APN分泌減少可通過降低細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞）內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶的含量水平［5，6］影響游離脂肪酸的代謝導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙、內(nèi)皮細(xì)胞的損傷以及通過激活A(yù)MPK途徑從而抑制 NF-k B途徑的激活［7］的作用減弱，均可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞聚集，造成各種炎癥介質(zhì)的大量釋放，其中血小板和白細(xì)胞釋放的血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）可強(qiáng)烈收縮血管、支氣管平滑肌和誘導(dǎo)血小板聚集，引起血管、支氣管痙攣和血管內(nèi)廣泛的微血栓形成，造成微循環(huán)障礙、組織缺氧壞死等病理性損害；此外，APN濃度降低引起內(nèi)皮細(xì)胞的損傷導(dǎo)致PGI2的表達(dá)減少，當(dāng)TXA2升高、PGI2降低，打破兩者濃度平衡時(shí)，可引發(fā)血管收縮、血小板聚集及血栓形成等從而加重ALI。本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定ALI不同時(shí)相的血漿APN濃度，得出4h、12h組的APN濃度與對(duì)照組相比明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；血漿中TXB2的濃度與對(duì)照組相比明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），6-keto-PGF1α較對(duì)照組在相應(yīng)時(shí)相表現(xiàn)出與APN濃度降低程度相一致的低表達(dá)濃度，李金玲等［8］所做的油酸致家兔急性肺損傷的結(jié)果與本結(jié)果一致。ALI時(shí)循環(huán)中APN水平的下降引起TXB2水平升高，具有拮抗它作用的6-keto-PGF1α的水平降低，TXB2／6-keto-PGF1α比例失衡，促炎反應(yīng)與代償性的抗炎反應(yīng)平衡被破壞，造成對(duì)機(jī)體的損害。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Jason M Konter［9］等所證實(shí)的低脂連素血癥可增加急性肺損傷的風(fēng)險(xiǎn)這一理論相符合。ALI時(shí)肺作為主要的靶器官，肺泡毛細(xì)血管膜和肺泡上皮損害，肺毛細(xì)血管通透性增加，富含蛋白質(zhì)的體液積聚于肺間質(zhì)和肺泡內(nèi)，導(dǎo)致肺水腫。早有 Miller M等［10］研究發(fā)現(xiàn)：氣道內(nèi)皮細(xì)胞也可分泌APN及表達(dá)APN功能性R1受體。雖然目前的研究主要集中在APN通過保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞減弱LPS誘導(dǎo)的ALI，APN也可能通過其他非細(xì)胞機(jī)制介導(dǎo)抗炎作用。之前有國(guó)外報(bào)告APN已被證明在體外可結(jié)合LPS［11］。但是如果這個(gè)機(jī)制發(fā)揮了重大的作用，BALF中細(xì)胞因子水平的下降應(yīng)該已經(jīng)出現(xiàn)在4h后，這與本實(shí)驗(yàn)中4h組的BALF中TXB2水平升高相矛盾，且本研究中BALF中的APN濃度的水平變化對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們可推測(cè)APN的非細(xì)胞抗炎作用并不是ALI調(diào)制作用的主要機(jī)制。此假設(shè)與Jason M Konter所研究的APN通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化減弱LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的實(shí)驗(yàn)調(diào)查結(jié)果相一致。本研究同時(shí)記錄了大鼠的肺損傷評(píng)分，血漿中APN水平與肺損傷評(píng)分結(jié)果呈較高的負(fù)相關(guān)（r=0.936，r2=0.877，P＜0.01）。BALF中APN含量則無相關(guān)性，進(jìn)一步說明血漿APN水平能夠反應(yīng)肺損傷的程度。ALI的炎癥反應(yīng)過程是逐漸發(fā)展變化的，本研究利用小劑量LPS建立了輕型ALI模型［12］，以利于研究ALI的發(fā)生、發(fā)展甚至修復(fù)等一系列病理過程，可動(dòng)態(tài)觀察各個(gè)指標(biāo)的變化，將有益于深入探討APN在其中的作用。

綜上所述，本研究表明APN參與了ALI的發(fā)生發(fā)展過程，且血漿APN水平可反映ALI程度。

［1］任海濤，姚蓉，曹鈺.脂連素在急性肺損傷中的機(jī)制探討［J］.實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2012，1（9）：1672-6170

［2］Tilg H，Moschen AR.Role of adiponectin and PBEF／visfatin as regulators of inflammation：involvement in obesity-associated diseases［J］.Clin Sci（Lond），2008，114：275-288

［3］Holland WL，Miller RA，Wang ZV，et al.Receptor-mediated activation of ceramidase activity initiates the pleiotropic actions of adiponectin［J］.Nat Med，2011，17：55-63

［4］Summer R，Little FF，Ouchi N，et al.Alveolar macrophage activation and an emphysema-like phenotype in adiponectin-deficient mice［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2008，294：1035-1042

［5］Yamauchi T，Kamon J，Minokoshi Y.Adiponectin stimulates glucoseutilization and fatty-acid oxidation by activating AMP-activatedprotein kinase［J］.Nature medicine，2002，8（11）：1288-1295

［6］Fruebis J，Tsao TS，Javorschi S.Proteolytic laeavage product of 30-k Da adipocyte complement-related protein increases fatty acid oxi-dation in muscle and causes weight loss in mice［J］.PNAS，2001，98（4）：2005-2010

［7］Noriyuki O，Hideki K，Shinji K.Adiponectin Stimulates Angiogenesis by Promoting Cross-talkbetween AMP-activated Pro-tein Kinase and Akt Signaling in Endothelial Cells［J］.The Journal of Biological Chemistry，2004，279（2）：1304-1309

［8］李金玲.CGRP對(duì)急性肺損傷家兔血漿TXB2和6-keto-PGF1α濃度的影響［J］.醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐，1999，12（2）：72-76

［9］Jason M Konter，Jennifer L Parker，Elizabeth Baez.Adiponectin attenuates LPS-induced acute lung injury throughsuppression of endothelial cell activation［J］.J lmmunol，2012，188（2）：854-863

［10］Miller M，Cho JY，Pahm A，et al.Adiponectin and functionaladiponex＿tin receptor 1 aI＿e expressed by airway epithelial cells in chroll—ic，stmefive pulmonary disease［J］.J lmmunol，2009，182（1）：684-691

［11］Tsuchihashi H，Yamamoto H，Maeda K，et al.Circulating Concentrations of Adiponectin，an Endogenous Lipopolysaccharide Neutralizing Protein，Decrease in Rats with Polymicrobial Sepsis［J］.Journal of Surgical Research，2006，134：348-353

［12］焦光宇，聶志偉，劉春利.小劑量脂多糖氣管內(nèi)滴注制備急性肺損傷動(dòng)物模型的探究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2007，4（15）：1005-4847