Cyclin E/CDK2及p27在胃癌細(xì)胞周期G1/S調(diào)控中的研究

張桂東,尹清臣

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院,河北 邯鄲 056000)

胃癌是在世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率居消化道惡性腫瘤的首位。腫瘤的發(fā)生是多因素引起的，包括多種抑癌基因的失活和癌基因的激活，目前細(xì)胞周期與腫瘤的關(guān)系越來越受到人們的重視。Cyclin E/CDK2及p27可調(diào)控細(xì)胞周期G1向S過渡，已有學(xué)者報(bào)道Cyclin E/CDK2在細(xì)胞中表達(dá)增高可能引起腫瘤的發(fā)生[1-2]，但大多數(shù)研究是采用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行檢測，而在定量指標(biāo)方面缺乏客觀性。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞蛋白定量的檢測具有快速、客觀、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測胃癌組織中Cyclin E/CDK2、p27蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖，探討其與胃癌發(fā)生及發(fā)展關(guān)系，并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行分析?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 收集我院2010年1月—2011年6月胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，每例標(biāo)本分別取癌組織及手術(shù)切緣正常胃組織(距癌邊緣5 cm以上)。部分固定于10%中性甲醛溶液，石蠟包埋切片，HE染色進(jìn)行病理診斷；部分固定于70%乙醇中用于流式細(xì)胞術(shù)檢測?；颊咝g(shù)前未經(jīng)任何抗癌治療。共選取60例胃腺癌及正常胃組織，其中男41例，女19例；年齡36～78歲，平均58.5歲，中位年齡60歲，>60歲25例，≤60歲35例。其中26例為高中分化腺癌，34例為低分化腺癌；侵襲至漿膜者有18例，侵襲至漿膜外者有42例；38例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，22例未轉(zhuǎn)移。

1.2主要試劑 鼠抗人Cyclin E抗體(HE12)，美國Santa Cruz公司；兔抗人CDK2抗體(Thr 160)，美國Santa Cruz公司；鼠抗人P27抗體(F-8)，美國Santa Cruz公司；羊抗鼠FITC標(biāo)記的IgG二抗，美國Jackson ImmunoResearch；羊抗兔FITC標(biāo)記的IgG二抗，美國Jackson ImmunoResearch。

1.3檢測方法 ①將臨床上手術(shù)取下來的標(biāo)本，經(jīng)10%中性甲醛溶液，石蠟包埋切片，HE染色，由兩名富有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師進(jìn)行病理診斷。②流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測。利用網(wǎng)搓法制備胃癌及正常胃組織的單細(xì)胞懸液,流式細(xì)胞術(shù)檢測胃癌及正常胃組織細(xì)胞周期染色,用Muticycle AV分析軟件對(duì)DNA細(xì)胞周期擬合分析，計(jì)算細(xì)胞周期各期的百分比，以流式細(xì)胞術(shù)一維直方圖表示。細(xì)胞增殖狀態(tài)以增殖指數(shù)(PI)表示，PI=(S+G2/M)/(G0/1+S+G2/M)×100%。胃癌及正常胃組織細(xì)胞中Cyclin E、CDK2及p27蛋白的表達(dá)嚴(yán)格按照試劑盒的要求上機(jī)檢測。在對(duì)免疫熒光標(biāo)記物測定時(shí)，分別設(shè)PBS代替一抗和二抗的陰性對(duì)照，以及只加一抗或二抗的同型對(duì)照。應(yīng)用Expo 32 ADC進(jìn)行免疫熒光數(shù)據(jù)分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測Cyclin E、CDK2及p27蛋白表達(dá)量以平均熒光強(qiáng)度(MFI)表示。

2 結(jié) 果

2.1胃癌及正常胃組織細(xì)胞PI比較 胃癌組織及正常胃組織細(xì)胞增殖指數(shù)分別為(40.62±5.07)%和(24.99±3.11)%，胃癌組織細(xì)胞增殖指數(shù)顯著高于正常胃組織(P<0.01)。

2.2胃癌及正常胃組織細(xì)胞中Cyclin E、CDK2、p27蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度比較 胃癌組織及正常胃組織細(xì)胞中Cyclin E蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度分別為(482.67±19.45)A.U.和(442.46±20.49)A.U.，CDK2蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度分別為(469.04±21.62)A.U.和(436.64±11.24)A.U.，p27蛋白表達(dá)熒光強(qiáng)度分別為(449.10±19.98)A.U.和(502.17±18.78)A.U.，胃癌組織與胃正常組織上述指標(biāo)比較均有顯著性差異(P均<0.01)。胃癌組織細(xì)胞中Cyclin E、CDK2及p27蛋白表達(dá)水平與不同臨床病理特征關(guān)系見表1。

3 討 論

表1 胃癌組織細(xì)胞中Cylin E、CDK2及p27蛋白表達(dá)水平(MFI)與不同臨床病理特征的關(guān)系

目前，惡性腫瘤已成為威脅人們生命健康的主要疾病之一。惡性腫瘤的早期診斷及治療對(duì)于患者的預(yù)后及生存期具有重要的意義。許多腫瘤患者就診時(shí)已是中晚期，且多數(shù)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療預(yù)后差、生存期短。因此，惡性腫瘤患者早期診斷及治療對(duì)于其生存及預(yù)后具有重大意義。惡性腫瘤發(fā)生過程中，從正常組織向癌變過程中，有細(xì)胞內(nèi)部一些蛋白表達(dá)的異常，這些異常表達(dá)的蛋白調(diào)控細(xì)胞惡變過程，檢測這些蛋白即腫瘤標(biāo)志物，可以為惡性腫瘤早期診斷提供客觀的檢測指標(biāo)。惡性腫瘤具有增殖旺盛的特點(diǎn)，考慮調(diào)控細(xì)胞周期的因素可能參與了惡性腫瘤的發(fā)生。本研究中利用流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測了不同胃病變組織中細(xì)胞周期情況，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞增殖指數(shù)顯著高于胃正常組織，表現(xiàn)出旺盛增殖的能力，這與目前研究的腫瘤具有增殖旺盛特點(diǎn)結(jié)果相一致。說明細(xì)胞周期的異常參與了胃癌的發(fā)生及發(fā)展。

Cyclin E 是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的主要因子，在細(xì)胞周期的各時(shí)相表達(dá)差異較大，在G1晚期和臨近S期表達(dá)量達(dá)到高峰，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入分裂期后，Cyclin E 被迅速降解，因此，Cyclin E是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1期向S期過渡的關(guān)鍵因子[3]。CDK2是CDK家族成員之一，可與Cyclin E形成功能性復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期由G1向S期過渡。

調(diào)控G1期向S期過渡的Cyclin-CDK復(fù)合物對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行起著關(guān)鍵性的作用，如其在細(xì)胞中異常表達(dá)，必然會(huì)影響細(xì)胞周期的順利進(jìn)行。體內(nèi)細(xì)胞周期對(duì)于維持正常機(jī)體具有重要作用，腫瘤細(xì)胞具有無控性增殖且增殖旺盛的特點(diǎn)。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期的調(diào)控因素紊亂有關(guān)，調(diào)控G1期向S期過渡的Cyclin E-CDK2復(fù)合物異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)。張志偉等[4]研究顯示，免疫組織化學(xué)方法檢測Cyclin E在胃癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Cyclin E蛋白主要在細(xì)胞核中表達(dá)，原發(fā)癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中Cyclin E 蛋白表達(dá)顯著高于正常胃黏膜、癌旁和非典型增生胃組織。馮曉潔等[5]報(bào)道，免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)果顯示Cyclin E在惡性涎腺多形性腺瘤中的陽性表達(dá)率顯著高于良性腺瘤，并且Cyclin E蛋白的表達(dá)與惡性腫瘤的浸潤性相關(guān)。張桂珍[6]研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin E在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)顯著高于正常皮膚，且與腫瘤分化程度有關(guān)(采用免疫組織化學(xué)方法檢測)。Jean-Francois等[7]研究顯示，Cyclin E蛋白的高表達(dá)可能與白血病的發(fā)生有關(guān)。Rakitina等[8]研究顯示，Cyclin E和CDK2的異常表達(dá)與大腸癌有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究利用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測胃癌組織中Cyclin E/CDK2蛋白表達(dá)水平，探討其與胃癌發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系。結(jié)果顯示，在胃癌組織中Cyclin E 及CDK2蛋白表達(dá)水平顯著高于正常胃組織，Cyclin E 及CDK2蛋白表達(dá)量增高可以促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期過渡使細(xì)胞呈現(xiàn)旺盛增殖能力，這與流式細(xì)胞術(shù)檢測得到的細(xì)胞周期的結(jié)果相一致。而且胃癌組織中Cyclin E 及CDK2蛋白的表達(dá)量與細(xì)胞分化程度、腫瘤浸潤性及轉(zhuǎn)移有關(guān)，低分化、浸潤至漿膜外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌細(xì)胞中Cyclin E 及CDK2蛋白的表達(dá)水平顯著高于高中分化、浸潤至漿膜、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌，提示Cyclin E 及CDK2蛋白的高表達(dá)可能參與了胃癌的發(fā)展過程。 細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制子主要包括INK4及Cip/Kip家族成員。INK4 家族包括p15，p16，p18和p19蛋白，特異與CDK4/6單體結(jié)合抑制Cyclin D的活性。而Cip/Kip家族包括p21，p27和p57蛋白，結(jié)合和滅活Cyclin-CDK 2復(fù)合物的異質(zhì)二聚體[9]。p27蛋白主要抑制Cyclin E/CDK2和Cyclin D/CDK4等激酶復(fù)合物的活性。p27在細(xì)胞中低表達(dá)或表達(dá)缺失可引起腫瘤的發(fā)生[10-11]。本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測不同病變胃組織中p27蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，胃癌組織中p27蛋白表達(dá)水平顯著低于胃正常組織，提示其異常表達(dá)可能參與了胃癌的早期發(fā)生。同時(shí)檢測到p27蛋白的表達(dá)量與細(xì)胞分化程度、腫瘤浸潤性及轉(zhuǎn)移有關(guān)，低分化、浸潤至漿膜外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌細(xì)胞中p27蛋白的表達(dá)水平顯著低于高中分化、浸潤至漿膜、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌，提示p27蛋白的低表達(dá)可能參與了胃癌的發(fā)展過程。

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