丹參酮ⅡA對(duì)阿霉素所致大鼠心肌損傷的保護(hù)作用

曹杰紅 徐寧紅 譚華清

[摘要] 目的 觀察丹參酮ⅡA對(duì)阿霉素所致大鼠心肌損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制。 方法 將SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組（阿霉素心臟損傷）、丹參酮ⅡA組（1.0×10-5、2.0×10-5、4.0×10-5 mol/L）。丹參酮ⅡA組大鼠造模前給予20 mL/kg體積丹參酮ⅡA混懸液灌胃，連續(xù)5 d，第5天給藥后1 h腹腔注射18 mg/kg阿霉素溶液，此后繼續(xù)灌胃2 d。檢查大鼠的心臟功能，檢測(cè)大鼠血漿乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）水平和心肌組織中肌鈣蛋白Ⅰ（cTnⅠ）水平。 結(jié)果 與模型組相比，丹參酮ⅡA組（2.0×10-5、4.0×10-5 mol/L）明顯改善心臟功能，表現(xiàn)為左室收縮壓[（75.14±16.08）mm Hg比（120.37±10.89）、（123.55±10.92）mm Hg，F(xiàn)=8.69]、左室壓力差[（65.32±17.37）mm Hg比（93.94±19.52）、（103.39±15.9）mm Hg，F(xiàn)=9.24]、左室內(nèi)壓最大上升速率[（3348.82±102.17）mm Hg/s比（4933.74±188.33）、（5188.75±205.14）mm Hg/s，F(xiàn)=9.83]和左室內(nèi)壓最大下降速率[（2559.72±433.62）mm Hg/s比（3353.94±203.15）、（3699.76±179.34）mm Hg/s，F(xiàn)=10.81]均顯著性升高（均P < 0.05）。與模型組比較，丹參酮ⅡA（2.0×10-5、4.0×10-5 mol/L）顯著降低了心肌組織勻漿中cTnⅠ[（1.23±0.58）ng/mgpr比（0.39±0.13）、（0.34±0.10）ng/mgpr，F(xiàn)=9.13]、LDH[（3460.91±656.37）U/L比（2874.11±1130.76）、（2608.12±538.25）U/L，F(xiàn)=8.84]、CK[（1.74±0.64）U/mL比（0.97±0.41）、（0.96±0.44）U/mL，F(xiàn)=8.64]和MDA[（8.34±2.86）μmol/mL比（5.19±1.92）、（5.00±1.44）μmol/mL，F(xiàn)=10.54]的水平，增加了SOD活性[（81.43±28.61）kU/L比（118.22±30.54）、（120.26±15.87）kU/L，F(xiàn)=9.68]（均P < 0.05）。 結(jié)論 丹參酮ⅡA對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是丹參酮ⅡA抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 丹參酮ⅡA；阿霉素；心肌損傷；氧化應(yīng)激

[中圖分類(lèi)號(hào)] R542.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）08（c）-0025-04

Protective effect of Tanshinone ⅡA on the cardiac injury induced by Adriamycin in rats

CAO Jiehong1 XU Ninghong1 TAN Huaqing2

1.Department of Oncology， the Central Hospital of Loudi City， Hu'nan Province， Loudi 417000， China； 2.Department of Cardiology， the Central Hospital of Loudi City， Hu'nan Province， Loudi 417000， China

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of Tanshinone ⅡA on the cardiac injury induced by Adriamycin and explore the probalble mechanism in rats. Methods The SD rats were randomly divided into control group， model group （Adriamycin-induced cardiac injury） and Tanshinone ⅡA group （1.0×10-5， 2.0×10-5， 4.0×10-5 mol/L）. Tanshinone ⅡA （20 mL/kg） was administered by lavage every day， in the fifth days， Adriamycin （18 mg/kg） was administered by intraperitoneal injection 1 hour after treatment with Tanshinone ⅡA. Then Tanshinone ⅡA was administered for 2 days. The cardiac function of rats was tested. The levels of cardiac troponin Ⅰ （cTnⅠ） in myocardial homogenate and plasma lactate dehydrogenase （LDH）， creatine kinase （CK）， malonaldehyde （MDA） and superoxide dismutase （SOD） were measured. Results Compared with the model group， the cardiac function of rats in model group was significantly improved， the left ventricular systolic pressure [（75.14±16.08） mm Hg vs （120.37±10.89）， （123.55±10.92） mm Hg， F=8.69]， left ventricular pressure difference [（65.32±17.37） mm Hg vs （93.94±19.52）， （103.39±15.9） mm Hg， F=9.24]， +dp/dtmax [（3348.82±102.17） mm Hg/s vs （4933.74±188.33）， （5188.75±205.14） mm Hg/s， F=9.83] and -dp/dtmin [（2559.72±433.62） mm Hg/s vs （3353.94±203.15）， （3699.76±179.34） mm Hg/s， F=10.81] were significantly increased in Tanshinone ⅡA （2.0×10-5， 4.0×10-5 mol/L） （all P < 0.05）. Compared with the model group， the levels of cTnⅠ [（1.23±0.58） ng/mgpr vs （0.39±0.13）， （0.34±0.10） ng/mgpr， F=9.13] in myocardial homogenate and plasma LDH [（3460.91±656.37） U/L vs （2874.11±1130.76）， （2608.12±538.25） U/L，F(xiàn)=8.84]， CK[（1.74±0.64） U/mL vs （0.97±0.41）， （0.96±0.44） U/mL， F=8.64] and MDA [（8.34±2.86） μmol/mL vs （5.19±1.92）， （5.00±1.44） μmol/mL， F=10.54] were significantly decreased （all P < 0.05） and the levels of plasma SOD [（81.43±28.61） kU/L vs （118.22±30.54）， （120.26±15.87） kU/L， F=9.68] were significantly increased （P < 0.05） in Tanshinone ⅡA （2.0×10-5， 4.0×10-5 mol/L）. Conclusion Tanshinone ⅡA improves the cardiac injury induced by Adriamycin， the mechanism can be related with the inhibition of oxidative stress induced by Tanshinone ⅡA.

[Key words] Tanshinone ⅡA； Adriamycin； Cardiac injury； Oxidative stress

阿霉素（Adriamycin，DOX）屬蒽醌類(lèi)抗生素，是一種高效、廣譜的抗腫瘤藥，臨床上常用于治療多種惡性腫瘤，其中對(duì)于白血病、惡性淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、肉瘤等多種腫瘤具有明顯的療效，然而阿霉素的毒副作用也嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用[1-2]。阿霉素心臟毒性的機(jī)制還不完全清楚，研究表明氧化應(yīng)激在阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。丹參酮ⅡA屬于中藥丹參的主要有效成分，丹參是傳統(tǒng)的中藥藥材，對(duì)改善缺血再灌注損傷、抗肝細(xì)胞損傷、免疫調(diào)節(jié)、抗感染和抗腫瘤等方面都有明顯效果[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)丹參注射液能夠保護(hù)心肌細(xì)胞損傷[7]，這種保護(hù)作用是否是通過(guò)丹參的活性成分丹參酮ⅡA來(lái)發(fā)揮，其具體機(jī)制目前尚不清楚。因此本研究觀察丹參酮ⅡA對(duì)阿霉素所致大鼠心肌損傷的保護(hù)作用，并從氧化應(yīng)激的角度探討丹參酮ⅡA保護(hù)阿霉素所致大鼠心肌損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參酮ⅡA購(gòu)于上海第一生化藥業(yè)有限公司（批號(hào)H31022558），阿霉素購(gòu)于Sigma公司，肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponin Ⅰ，cTnⅠ）（批號(hào)2401402）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）（批號(hào)20130521）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）（批號(hào)20130302）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）（批號(hào)20130631）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）（批號(hào)20131022）的檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及造模 SPF級(jí)健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠50只，體量（200±20）g，由南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，普通飼料飼養(yǎng)。大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組，模型組（阿霉素心臟損傷），丹參酮ⅡA組（1.0×10-5、2.0×10-5、4.0×10-5 mol/L）。阿霉素心臟損傷模型組大鼠腹腔注射18 mg/kg鹽酸阿霉素溶液。丹參酮ⅡA組大鼠造模前每天灌胃20 mL/kg體積丹參酮ⅡA混懸液，連續(xù)5 d，第5天給藥后1 h腹腔注射18 mg/kg阿霉素溶液，此后繼續(xù)灌胃2 d。模型組大鼠在實(shí)驗(yàn)的第5天腹腔注射18 mg/kg 阿霉素溶液，模型組和對(duì)照組大鼠均每天給予20 mL/kg的生理鹽水，連續(xù)7 d。

1.2.2 心肌功能檢測(cè) 各組大鼠用3.5%的水合氯醛（1 mL/100g）腹腔注射麻醉，打開(kāi)胸腔，固定，心窺器使心臟暴露。心臟連接到壓力轉(zhuǎn)換器，注射針直接從左心室腔的頂點(diǎn)附近插入，并保持流暢，壓力轉(zhuǎn)換器的另一端被連接到的生物信號(hào)采集系統(tǒng)，保持受試動(dòng)物的收縮壓和噴射狀態(tài)穩(wěn)定，使用很短的時(shí)間內(nèi)測(cè)定動(dòng)物心臟功能，包括心率（heart rate，HR）、左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室壓力差（left ventricular pressure difference，△LVP）、左室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）和左室內(nèi)壓最大下降速率（-dp/dtmin）。

1.2.3 血漿LDH、CK、MDA、SOD水平的測(cè)定 大鼠心肌功能檢測(cè)完畢后，心臟放血，肝素抗凝，離心，取血漿，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，分別檢測(cè)血漿LDH、CK、MDA和SOD水平。

1.2.4心肌勻漿心肌cTnⅠ水平檢測(cè) 大鼠處死后，取心臟。取適量的心肌組織在冰浴條件下使用組織研磨機(jī)進(jìn)行3次粉碎組織，用20%的Tris-HCl溶液沖洗磨攪拌器，然后用超聲波組織細(xì)胞粉碎機(jī)裂解細(xì)胞，制備成心肌組織勻漿。0℃，2000 g，離心10 min，收集上清液。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)心肌組織勻漿上清液中cTnⅠ的含量。檢測(cè)勻漿上清液中總蛋白的含量，cTnⅠ的含量以每毫克組織蛋白中所含cTnⅠ的鈉克數(shù)（ng/mgpr）表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對(duì)阿霉素所致大鼠心臟功能損傷的影響

與對(duì)照組比較，阿霉素?fù)p傷的模型組大鼠LVSP、△LVP、±dp/dtmax均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。丹參酮ⅡA組（2.0×10-5 mol/L和4.0×10-5 mol/L）與模型組比較，LVSP、△LVP、±dp/dtmax均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。丹參酮ⅡA組（1.0×10-5 mol/L）LVSP、△LVP、±dp/dtmax與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 丹參酮ⅡA對(duì)阿霉素所致心臟損傷大鼠心肌組織中cTnⅠ和血漿CK和LDH水平的影響

與對(duì)照組比較，阿霉素心臟損傷模型組大鼠心肌組織中cTnⅠ和血漿中CK和LDH水平顯著性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）；丹參酮ⅡA組（2.0×10-5 mol/L和4.0×10-5 mol/L）與模型組比較，大鼠心肌組織中cTnⅠ和血漿中CK和LDH水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）；丹參酮ⅡA組（1.0×10-5 mol/L）大鼠心肌組織中cTnⅠ和血漿中CK和LDH水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P > 0.05）。見(jiàn)表2。

表2 丹參酮ⅡA對(duì)各組大鼠心肌組織中肌鈣蛋白Ⅰ

及血漿中肌酸激酶和乳酸脫氫酶水平的影響（x±s）

注：與對(duì)照組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；cTnⅠ：肌鈣蛋白I；CK：肌酸激酶；LDH：乳酸脫氫酶

2.3丹參酮ⅡA對(duì)阿霉素所致心臟損傷大鼠血漿中MDA和SOD水平的影響

與對(duì)照組比較，阿霉素心臟損傷模型組大鼠血漿中MDA的含量顯著升高，而SOD含量顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。丹參酮ⅡA組（2.0×10-5 mol/L和4.0×10-5 mol/L）與模型組比較，大鼠血漿中MDA的含量顯著降低，而SOD含量顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。而丹參酮ⅡA組（1.0×10-5 mol/L）大鼠血漿中MDA和SOD水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ﹥ 0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

阿霉素是蒽醌類(lèi)抗生素，也是一種高效廣譜的抗腫瘤藥物。有研究報(bào)道用蒽醌類(lèi)抗生素對(duì)白血病患兒進(jìn)行化療時(shí)可引起擴(kuò)張型心肌病[8]。大量臨床調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究也發(fā)現(xiàn)阿霉素具有心臟毒性，可導(dǎo)致心肌損傷，主要臨床表現(xiàn)為用藥早期出現(xiàn)各種心律失常，晚期出現(xiàn)還可以出現(xiàn)充血性心力衰竭[9]，因此阿霉素做為抗腫瘤藥物在臨床上的使用受到很大的限制。但是阿霉素的抗腫瘤的效果是很肯定的，因而尋找高效低毒的抑制阿霉素心臟毒性的心臟保護(hù)劑具有十分重要的意義。

丹參是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，在中醫(yī)中丹參有“益氣、行氣、活血、養(yǎng)血和祛痹”等作用。丹參酮ⅡA是丹參的脂溶性有效單體，研究表明丹參酮ⅡA具有改善微循環(huán)、抗缺血缺氧、抗動(dòng)脈硬化、降低心肌耗氧量、保護(hù)心肌、抗血栓形成、抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等保護(hù)作用[10-13]。

心臟功能是反映心肌損傷程度最直接的指標(biāo)，LVSP和±dp/dt可以反映心肌收縮和舒張功能，當(dāng)心肌舒張時(shí)，實(shí)際值比絕對(duì)值大，當(dāng)心肌收縮時(shí)，實(shí)際值比絕對(duì)值小，若回收率更好則說(shuō)明心肌功能更強(qiáng)[14]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，阿霉素模型組LVSP、±dp/dt明顯降低，說(shuō)明阿霉素引起的嚴(yán)重心肌損害，降低了心功能指標(biāo)。丹參酮ⅡA干預(yù)后，顯著改善了這些指標(biāo)，表明丹參酮ⅡA可有效改善左室收縮和舒張功能，降低阿霉素導(dǎo)致的心臟功能下降。

研究發(fā)現(xiàn)，心肌血漿的酶水平與心肌功能具有密切關(guān)系，當(dāng)心肌出現(xiàn)損傷時(shí)，會(huì)使酶水平異常，一般會(huì)導(dǎo)致酶外漏。CK、LDH則是評(píng)價(jià)心肌缺血損害程度的客觀指標(biāo)[15]。cTnⅠ水平表示不可逆的心肌損傷的程度，cTnⅠ具有廣泛的診斷價(jià)值，能夠快速診斷閾值，特異性、敏感性高，成為心肌損傷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，丹參酮ⅡA顯著降低了阿霉素所致心肌損傷大鼠心肌組織勻漿中cTnⅠ水平及血漿LDH和CK的水平。這些結(jié)果表明丹參酮ⅡA能夠有效緩解心肌的損傷，從而對(duì)阿霉素引起的心肌損傷起到保護(hù)作用。

阿霉素心臟毒性的機(jī)制目前還沒(méi)有完全闡明，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基導(dǎo)致心肌損傷是其心臟毒性的機(jī)制之一。氧化應(yīng)激是引起腦缺血-再灌注損傷的重要機(jī)制。氧化應(yīng)激是指機(jī)體在遭受有害刺激時(shí)，產(chǎn)生了大量的活性氧自由基，超出了機(jī)體對(duì)其清除能力，從而對(duì)細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等造成巨大的損傷[17-18]。MDA是活性氧發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，是衡量體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激的指標(biāo)之一。SOD是清除體內(nèi)活性氧自由基的主要自由基清除劑，通過(guò)催化超氧化物發(fā)生歧化反應(yīng)而清除自由基[19-20]。丹參酮ⅡA能顯著增加阿霉素所致心臟損傷大鼠血漿中SOD活性，同時(shí)降低MDA含量，說(shuō)明丹參酮ⅡA具有清除氧自由基的作用，使心肌細(xì)胞壞死明顯減少。因此丹參酮ⅡA可能是通過(guò)提高體內(nèi)抗氧化酶活性，對(duì)抗自由基引發(fā)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，改善細(xì)胞膜的通透性，保護(hù)結(jié)構(gòu)的完整性，避免心肌損傷進(jìn)一步加重，保護(hù)心肌細(xì)胞，這可能是丹參酮ⅡA保護(hù)阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷的機(jī)制之一。

綜上所述，丹參酮ⅡA改善了阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心肌損傷，其機(jī)制可能是丹參酮ⅡA抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究為丹參類(lèi)藥物作為抑制阿霉素心臟毒性的心臟保護(hù)劑的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)于阿霉素等藥物的廣泛使用具有積極的推動(dòng)作用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Gupta AA，Yao X，Verma S，et al. Chemotherapy（gemcitabine，docetaxel plus gemcitabine，doxorubicin，or trabectedin）in inoperable，locally advanced，recurrent，or metastatic uterine leiomyosarcoma：a clinical practice guideline [J]. Curr Oncol，2013，20（5）：448-454.

[2] Terlizzi M，Popolo A，Pinto A，et al. Plasmacytoid dendritic cells contribute to Doxorubicin-induced tumor arrest in a mouse model of pulmonary metastasis [J]. J Immunother，2014，37（4）：214-224.

[3] Daosukho C，Chen Y，Noel T，et al. Phenylbutyrate，a histone deacetylase inhibitor，protects against Adriamycin-induced cardiac injury [J]. Free Radic Biol Med，2007，42（12）：1818-1825.

[4] Saleem MT，Chetty MC，Kavimani S. Antioxidants and tumor necrosis factor alpha-inhibiting activity of sesame oil against doxorubicin-induced cardiotoxicity [J]. Ther Adv Cardiovasc Dis，2014，8（1）：4-11.