AKT/PI3K信號通路介導(dǎo)的干細(xì)胞動員在抗心梗后心律失常中的作用

蘇楓 王加紅 陳楠楠 姚建華 唐靜輝 龔群林 張少衡

基礎(chǔ)研究

AKT/PI3K信號通路介導(dǎo)的干細(xì)胞動員在抗心梗后心律失常中的作用

蘇楓 王加紅 陳楠楠 姚建華 唐靜輝 龔群林 張少衡

作者單位：200090 上海市，同濟大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院心內(nèi)科

目的 探討心肌梗死（MI）后絲氨酸/蘇氨酸/磷脂酰肌醇-3激酶（AKT/PI3K）信號通路介導(dǎo)的心臟干細(xì)胞（CSCs）動員對抗心梗后心律失常的影響。方法 將大鼠隨機分為5組，每組20只：對照組（CON組）、結(jié)扎組（LI組）、結(jié)扎+注射組（LI+LY 組）、缺血預(yù)處理+結(jié)扎組（IP+LI組）、缺血預(yù)處理+結(jié)扎+注射組（IP+LI+LY組）。采用結(jié)扎LAD的方法建立心梗模型，采用流式細(xì)胞分析、ELISA法等檢測各組AKT/PI3K信號通路相關(guān)指標(biāo)的表達情況及心律失常的發(fā)生情況。結(jié)果 LI+LY組炎癥反應(yīng)顯著高于其他各組，IP+LI組顯著低于 IP+LI+LY 組、LI+LY 組、LI組（P＜0.05）；IP+LI組比 LI組 CD34+、Oct4+細(xì)胞的數(shù)量多（P＜0.05）；與CON組相比，IP+LI組SDF-1表達顯著增加，LI+LY組及LI組表達明顯減少（P＜0.05）；與LI組比較，IP+LI組心律失常的發(fā)生率明顯降低，QTc間期也明顯縮短（P＜0.05）。結(jié)論 通過激活內(nèi)源性Akt/PI3K信號通路，可有效促進內(nèi)源性心臟干細(xì)胞動員及歸巢，使心肌細(xì)胞再生，從而改善心臟功能，降低心肌缺血后室性心律失常的發(fā)生。

信號通路； 心肌梗死； 心律失常； 干細(xì)胞動員； 絲氨酸蘇氨酸激酶； 1-磷脂酰肌醇-3激酶

急性心肌梗死（AMI）是引起心血管疾病死亡的主要原因之一，超過50%的幸存者死于室性心律失常[1]。早期預(yù)防和治療AMI后室性心律失常已成為降低AMI患者死亡率的重要措施。AMI后梗死心肌自身存在的心臟干細(xì)胞（CSC/CPCs）可通過自我更新、克隆增殖實現(xiàn)干細(xì)胞修復(fù)[2]。但CSCs數(shù)量極為有限，其再生能力無法滿足受損的心肌細(xì)胞與心臟功能，故研究通過動員CSCs使其最大限度地促進AMI后心臟修復(fù)已成為研究的焦點問題。研究發(fā)現(xiàn)，絲氨酸蘇氨酸激酶/1-磷脂酰肌醇-3激酶（AKT/PI3K）信號通路與梗死心肌中CSCs的動員、遷移密切相關(guān)[3,4]。本研究利用結(jié)扎大鼠左冠狀動脈前降支（LAD）制備動物模型，觀察AKT/PI3K信號通路相關(guān)分子的表達情況，分析其與動物心臟心律失常發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系，以期闡明AKT/PI3K信號通路介導(dǎo)的干細(xì)胞動員對抗心梗后室性心律失常的作用。

1 資料與方法

1.1 主要材料 健康SD大鼠（100只）購自中國科學(xué)院動物所，體質(zhì)量 250～300（278.1±12.3）g。

1.2 實驗分組 將大鼠隨機分為5組，每組20只。①對照組（CON組）：開胸，在LAD下穿線但不結(jié)扎；②結(jié)扎組（LI組）：開胸，在LAD下穿線結(jié)扎；③結(jié)扎+注射組（LI+LY組）：結(jié)扎LAD即刻在壞死心肌部位注射LY294002 0.3 mg/kg；④缺血預(yù)處理+結(jié)扎組（IP+LI組）：結(jié)扎LAD 5 min松開再灌注5 min，重復(fù)3次后再結(jié)扎30 min再灌注120 min，再行結(jié)扎處理；⑤缺血預(yù)處理+結(jié)扎+注射組（IP+LI+LY組）：先行缺血預(yù)處理，結(jié)扎LAD即刻在壞死心肌部位注射LY294002 0.3 mg/kg，操作方法同上。

1.3 動物模型制備 采用氯胺酮（50 mg/kg）麻醉大鼠后行氣管插管，呼吸機輔助通氣。于左胸第4肋間開胸，切開心包，在左心耳下緣與肺動脈圓錐之間結(jié)扎LAD，由心電圖和心臟顏色變化證實心肌梗死模型制備成功。實驗動物操作過程遵照上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院動物倫理委員會規(guī)程進行。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 炎癥及壞死指標(biāo)測定 取梗死區(qū)心肌組織制成5%的勻漿液，采用比色法測定髓過氧化物酶（MPO）、活性氧（ROS）的含量，采用熒光定量PCR檢測hs-CRP濃度，操作步驟按說明書進行。

1.4.2 流式細(xì)胞分析 取外周血50 μl，再分別加入直接熒光標(biāo)記抗體 FITC-Lin、PE-CD45、Alexa Fluor 647-CXCR4及同型對照抗體，染色30 min，加入溶血素2 ml裂解紅細(xì)胞10～15 min，離心后棄上清液，PBS洗滌細(xì)胞2次，標(biāo)本置于流式細(xì)胞儀檢測外周血中CD34+、Oct4+、VSEL細(xì)胞數(shù)量。

1.4.3 ELISA檢測 取心肌缺血組織的勻漿液，采用ELISA法測定Akt、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（SDF-1）水平，操作步驟按說明書進行。

1.4.4 心律失常 麻醉大鼠，四肢皮下插入針電極接監(jiān)護儀行心電監(jiān)護0.5 h，描記心電圖，觀察QTc間期、室性心律失常發(fā)生情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 運用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組炎癥及壞死指標(biāo)比較 H&E染色顯示，與CON組比較，心肌梗死顯著引起的炎癥，包括中性粒細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞丟失和出血方面，沒有預(yù)適應(yīng)的結(jié)扎鼠比帶預(yù)適應(yīng)結(jié)扎鼠的局部缺血反應(yīng)更嚴(yán)重。LI+LY組炎癥指標(biāo)包括hs-CRP、MPO和ROS的定量指標(biāo)顯著高于CON組及其他各組，IP+LI組各炎癥指標(biāo)顯著低于IP+LI+LY組、LI+LY組和LI組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組炎癥及壞死指標(biāo)比較（±s）

表1 各組炎癥及壞死指標(biāo)比較（±s）

注：與 CON 組比較，aP＜0.05；與 LI+LY 組比較，bP＜0.05；與 IP+LI組比較，cP＜0.05

組別 例數(shù) hs-CRP（ng/ml）MPO（nmol/L）CON 組 20 508.70±13.30 14.71±4.63 2.41±1.17 IP+LI+LY 組 20 573.50±21.70abc20.40±9.30abc3.39±1.44abcLI+LY 組 20 871.10±51.70a28.13±5.24a5.17±1.76aIP+LI組 20 519.50±71.60ab15.51±4.32ab2.59±1.42bLI組 20 576.30±41.74abc22.14±4.18abc3.73±1.74abcROS（nmol/L）

2.2 血循環(huán)CD34+、Oct4+、VSEL在各群體中的比較 流式細(xì)胞儀顯示，CON組、IP+LI+LY組、LI+LY組無差異。然而，同樣沒有注射LY294002，IP+LI組比LI組CD34+、Oct4+細(xì)胞數(shù)量多。見表2。

2.3 心肌缺血中的Akt和SDF-1表達 與CON組相比，IP+LI組SDF-1表達顯著增加，LI+LY組及LI組表達明顯減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。LI+LY組及LI組SDF-1表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組Akt的表達水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 各組室性心律失常的發(fā)生 與LI組比較，IP+LI組心律失常的發(fā)生率明顯降低，QTc間期也明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表2 血循環(huán)CD34+、Oct4+、VSEL在各群體中的比較（±s）

表2 血循環(huán)CD34+、Oct4+、VSEL在各群體中的比較（±s）

注：與 LI組比較，aP＜0.05

組別 例數(shù) CD34+（105/L） Oct4+（105/L） VSEL（105/L）CON 組 20 48.7±7.3 12.74±3.36 42.4±10.7 IP+LI+LY 組 20 51.5±9.7 19.40±5.32 43.9±9.4 LI+LY 組 20 51.9±10.1 26.14±5.38 44.1±9.6 IP+LI組 20 53.3±11.6a14.93±4.28a42.5±11.2 LI組 20 48.1±9.4 22.08±5.63 43.7±8.7

表3 各組心肌缺血中的Akt和SDF-1表達（±s）

表3 各組心肌缺血中的Akt和SDF-1表達（±s）

注：與 IP+LI組比較，aP＜0.05；與 CON 組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) Akt SDF-1（pg/mg）CON 組 20 0.075±0.013 7.62±1.27 IP+LI+LY 組 20 0.084±0.023 7.95±1.35aLI+LY 組 20 0.068±0.014 5.11±1.64abIP+LI組 20 0.082±0.012 13.72±4.73bLI組 20 0.079±0.023 5.02±1.04ab

表4 各組室性心律失常發(fā)生情況［±s，例數(shù)及百分率（%）］

表4 各組室性心律失常發(fā)生情況［±s，例數(shù)及百分率（%）］

注：與 CON 組比較，aP＜0.05；與 LI組比較，bP＜0.05

組別 例數(shù) QTc間期（ms） 心律失常的發(fā)生率CON 組 20 412.075±51.13 3（15.0）IP+LI+LY 組 20 441.784±49.05a15（75.0）aLI+LY 組 20 439.568±45.03a13（65.0）aIP+LI組 20 430.12±41.02b18（90.0）abLI組 20 458.81±52.73a12（60.0）a

3 討論

研究表明心肌梗死后梗死心肌自身存在C-Kit、MDR、Sca-1、Isl-1、MDR 等多種 CSCs，具有自我更新、克隆增殖的功能，可在心臟組織內(nèi)分化為心臟的多種細(xì)胞成分，在梗死心肌形成一個天然的干細(xì)胞修復(fù)過程，并對存活心肌的電和機械功能產(chǎn)生重要影響[5,6]。但AMI后心臟自體存在的CSCs數(shù)量非常有限，且慢性缺血心肌這種分化進一步減少，故其再生能力遠不足以彌補損傷的心肌細(xì)胞數(shù)量和心臟功能。目前研究認(rèn)為，AKT/PI3K信號通路與梗死心肌中CSCs的動員、遷移密切相關(guān)，可調(diào)控循環(huán)血干細(xì)胞歸巢、梗死心肌局部干細(xì)胞生存和血管新生，促進梗死心肌功能修復(fù)并降低死亡率[7,8]。但其對心梗后室性心律失常的影響尚不明確。

缺血預(yù)處理（IPC）是一種內(nèi)源性心肌保護方法，可減少心肌缺血再灌注過程中的氧自由基，抑制去甲腎上腺素的過度分泌等，發(fā)揮心肌保護作用[9]。H&E染色顯示，未預(yù)適應(yīng)的結(jié)扎鼠較預(yù)適應(yīng)結(jié)扎鼠的中性粒細(xì)胞浸潤、心肌細(xì)胞丟失及局部缺血反應(yīng)更嚴(yán)重，且LI+LY組炎癥反應(yīng)顯著高于CON組及其他各組，IP+LI組顯著低于IP+LI+LY組、LI+LY 組、LI組（P＜0.05），進一步說明 IPC 能改善缺血再灌注心肌的功能，減輕心肌損傷，具有明顯的心肌保護效應(yīng)。此外，IP+LI組SDF-1表達明顯增加，而Akt抑制劑能明顯減弱SDF-1的表達，但無法改變Akt的表達水平，其原因是Akt抑制劑只能降低Akt的磷酸化水平，提示在心臟性猝死動物心肌梗死模型中，IPC對Akt/PI3K介導(dǎo)的信號途徑調(diào)節(jié)干細(xì)胞歸巢可產(chǎn)生有利影響[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1和內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）表面的CXCR4介導(dǎo)了EPCs的遷移，但這種遷移可被Akt抑制劑所阻斷[11]。梗死區(qū)的SDF-1/CXCR4軸在介導(dǎo)干細(xì)胞歸巢的同時，還可激活PI3K/Akt/eNOS等下游路徑，通過Akt介導(dǎo)的信號通路動員干細(xì)胞歸巢至梗死心肌，從而對心肌細(xì)胞提供營養(yǎng)保護支持，維護心電穩(wěn)定，發(fā)揮抗心肌梗死后室性心律失常的作用[12,13]。

流式細(xì)胞儀顯示，CON組、IP+LI+LY組、LI+LY組CD34+、Oct4+細(xì)胞的數(shù)量無差異，但同樣沒有注射 LY294002，IP+LI組比 LI組 CD34+、Oct4+細(xì)胞的數(shù)量多，表明CD34+、Oct4+對維持心肌細(xì)胞及CSCs的存活具有重要作用，其作用可能與PI3K/Akt信號通路有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，QTc間期延長是慢性心力衰竭心源性猝死的獨立預(yù)測指標(biāo)，可能與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)過度激活有關(guān)[14]。與LI組比較，IP+LI組心律失常的發(fā)生率明顯降低，QTc間期也明顯縮短（P＜0.05），說明IPC可顯著改善血流動力學(xué)，減少心肌梗死后心律失常的發(fā)生。

綜上所述，在心肌梗死早期，通過激活內(nèi)源性Akt/PI3K信號通路，可有效促進內(nèi)源性心臟干細(xì)胞動員及歸巢，使心肌細(xì)胞再生，從而改善心臟功能，降低心肌缺血后室性心律失常的發(fā)生，同時也為干細(xì)胞再生心肌減少室性心律失常研究提供新的理論依據(jù)。

［1］何曉燕，羅裕，張代富，等.急性心肌梗死早期使用倍他樂克預(yù)防心律失常的療效分析.中國心血管病研究，2008，6：413-415.

［2］Fayard E，Xue G，Parcellier A，et al.Protein Kinase B（PKB/Akt），a Key Mediator of the PI3K Signaling Pathway.Current Topics in Microbiology and Immunology，2011，346：31-56.

［3］Dato GM，Sansone F，Omedé P，et al.Preoperative mobilizationofbone marrow-derived cellsfollowed by revascularization surgery： early and long-term outcome.Int J Artif Organs，2012，35：67-76.

［4］Bruel-Jungerman E，Veyrac A，Dufour F，et al.Inhibition of PI3K-Akt signaling blocks exercise-mediated enhancement of adult neurogenesis and synaptic plasticity in the dentate gyrus.PLoS One，2009，11：1113-1115.

［5］Yamahara K，F(xiàn)ukushima S，Coppen SR，et al.Heterogeneic nature of adult cardiac side population cells.Biochemical and Biophysical Research Communications，2008，371：615-620.

［6］常海霞，鞏曉宏，尚磊，等.中性粒細(xì)胞升高對急性心肌梗死發(fā)生嚴(yán)重心律失常的預(yù)測意義.中國心血管病研究，2012，10：661-672.

［7］Zhang S，Zhao L，Shen L，et al.Comparison of various niches for endothelial progenitor cell therapy on ischemic myocardial repair coexistence of host collateralization and Akt-mediated angiogenesis produces a superior microenvironment.Arteriosclerosis，thrombosis，and vascular biology，2012，32：910-923.

［8］Downey JM，Krieg T，Cohen MV，et al.Mapping preconditioning’s signaling pathways.Ann NY Acad Sci，2008，1123：187-196.

［9］Hur J，Yoon CH，Lee CS，et al.Akt is a key modulator of endothelial progenitor cell trafficking in ischemic muscle.Stem Cells，2007，25：1769-1778.

［10］ Zheng H，F(xiàn)u G，Dai T，et al.Migration of endothelial progenitor cells mediated by stromal cell-derived factor lalpha/CXCR4 via PI3K/Akt/eNOS signal transduction pathway.J Cardi ovasc Pharmacol，2007，50：274-280.

［11］ Yamaguchi J，Kusano KF，Masuo O，et al.Stromal cellderived factor-1 effects on exvivo expanded endothelial progenitorcellrecruitmentforischemic neovascularization.Circulation，2003，107：1322-1328.

［12］Yu J，Li M，Qu Z，et al.SDF-1/CXCR4-mediated migration of transplanted bone marrow stromal cells toward areas of heart myocardial infarction through activation of PI3K/Akt.J Cardiovasc Pharmacol，2010，55：496-505.

［13］Hu T，Liu S，Breiter DR，et al.Octamer 4 small interfering RNA results in cancer stem cell-like cell apoptosis.Cancer Res，2008，68：6533-6540.

［14］Kjaer A，Hesse B .Heart failure and neuroendocrine activation：diagnostic， prognostic and therapeutic perspectives. Clin Physiol，2001，21：661-672.

Study on the role of stem cell mobilization mediated by AKT/PI3K signaling pathway in the cardiac arrhythmia after myocardial infarction

SU Feng，WANG Jia-hong，CHEN Nan-nan，et al.Department of Cardiology，Yangpu Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200090，China

Objective To explore the influence of CSCs stem cell mobilization mediated by AKT/PI3K signaling pathway on the cardiac arrhythmia after myocardial infarction.Methods 100 Male rats were divided randomly into five groups（n=20）including control group（CON），ligation group（LI），ligation+LY294002 group（LI+LY），ischemic preconditioning+ligation（IP+LI），ischemic preconditioning+ligation+LY294002（IP+LI+LY）.MI model was induced by left anterior descending artery ligatior（LAD），flow cytometry and ELISA were used to detect the expression of AKT/PI3K related indicators，and the incidence of cardiac arrhythmia was recorded.Results LI+LY group had a significantly higher inflammatory reaction than CON group and other groups，and IP+LI group was significantly lower than IP+LI+LY，LI+LY，LI group（P＜0.05）.The number of CD34+，Oct4+in IP+LI group were significantly more than LI group（P＜0.05）.Compared with CON group，the expression of SDF-1 in IP+LI group were significantly increased，but they were decreased significantly in LI+LY group and LI group（P＜0.05）.Compared with LI group，the incidence of arrhythmia in IP+LI group was obviously lower，QTc interphase also significantly reduced（P＜0.05）.Conclusion By activating endogenous PI3K/Akt signaling pathway,which can effectively promote endogenous cardiac stem cells mobilization and homing，enhancement of myocardial cell regeneration，and improve heart function，reduce the occurrence of arrhythmia after MI.

Signaling pathway； Myocardial infarction； Arrhythmia； Stem cell mobilization； AKT；PI3K

上海市衛(wèi)生局課題面上項目（項目編號：21034334）

10.3969/j.issn.1672－5301.2014.08.017

Q95-33；R541.7

A

1672-5301（2014）08-0732－04

2014-05-20）