高效液相色譜法測定葛根素含量的色譜條件研究

羅建成

（河南南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽473004）

高效液相色譜法測定葛根素含量的色譜條件研究

羅建成

（河南南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽473004）

目的研究高效、靈敏、快速的葛根素檢測方法。方法利用高效液相色譜法，研究流動相的種類、配比、波長、流速、柱溫等因素對葛根素測定的影響。結(jié)果得出色譜條件為：流動相為甲醇-0.1%枸櫞酸，配比為25∶75，波長為250 nm，流速為1mL／min，溫度為30℃。結(jié)論此法操作簡單、實驗時間短、靈敏度高，用于實際樣品分析檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

高效液相色譜法；色譜條件；葛根素含量

葛根是豆科植物的塊根，葛根總黃酮是葛根的有效成分［1-2］，而葛根素則是葛根總黃酮中含量最多的黃酮化合物［3］。藥理研究表明，葛根素可明顯擴(kuò)張冠狀血管，可使正常和痙攣狀態(tài)下的冠狀血管擴(kuò)張，可降低心肌耗氧，改善心肌收縮功能，促進(jìn)血液循環(huán)［4-6］。據(jù)文獻(xiàn)報道用不同型號的色譜儀測定葛根素含量［7-9］，流動相的種類及配比不同，流速也不同。本實驗所采用的是美國惠普公司生產(chǎn)的型號為HP1100的色譜儀，通過研究不同的色譜條件從中選出最佳的操作條件［10-12］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備：美國惠普高效液相色譜儀HP1100，VWD可變波長檢測器，N2000化學(xué)工作站色譜柱：Hypersil ODS（4.6×250mm，5μm）

1.1.2 試劑：葛根素對照品（110752-20051）：中國藥品生物制品檢定所；葛根素供試品：河南省宛西制藥股份有限公司自制，含量為99.8%；色譜甲醇、枸櫞酸、去離子水。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制［1，13-14］：對照溶液制備：精密稱取干燥恒定過的葛根素0.025g于50mL的容量瓶中溶解并稀釋至刻度，再吸取稀釋后溶液5mL于50mL的容量瓶中稀釋至刻度，溶液濃度為0.05mg／mL。

供試品溶液的制備：精密稱取樣品0.025 g于50mL容量瓶中溶解并稀釋至刻度，再吸取稀釋后溶液5 mL于50 mL的容量瓶中稀釋至刻度，所得溶液濃度為0.05mg／mL。

10%的異丙醇：取10mL的異丙醇定容到100mL，配好的溶液也需要經(jīng)過有機(jī)系膜過濾。

色譜甲醇：作為洗脫液，首先經(jīng)過有機(jī)系膜過濾，然后再進(jìn)行超聲脫氣。

1.2.2 實驗方法：本研究選擇4種流動相：甲醇-水，甲醇-0.1%枸櫞酸，乙醇-水，乙腈-水；流動相的配比選擇5組：75∶25、50∶50、30∶70、25∶75、20∶80；流動相的波長選擇190 nm、220 nm、250 nm、280 nm、310 nm 5個不同波長；流動相的流速選擇0.4mL／min，0.6mL／min，0.8mL／min，1.0mL／min 4組流速；選取5個柱溫25℃，30℃，35℃，40℃，45℃等因素進(jìn)行研究，在其它色譜條件不變的情況下，測定葛根素的含量，從中選出合適的色譜操作條件，準(zhǔn)確且快速的測定其含量。

色譜條件：色譜柱：Hypersil ODS，C18柱（5μm）；檢測波長：190～310 nm；柱溫：25～45℃；流動相配比采用5組；進(jìn)樣量：20 μL；理論板數(shù)按葛根素計算不低于5000。流動相：流速：0.4～1.0mL／min。采用梯度洗脫，程序：0～5min A／B（0∶100）；5～25min A／B（11∶89）；25～40min A／B（17∶83）；40～50min A／B（35∶65）；50～70min A／B（78∶22）。

1.2.3 結(jié)果計算

2 結(jié)果

2.1 流動相種類的影響 分別采用流動相為甲醇-水，甲醇-0.1%枸櫞酸，乙醇－水，乙腈－水，配比在25∶75，流速在1mL／min，波長為250 nm，溫度在30℃的條件下，測定葛根素的含量，從中選取最佳的流動相。其測定的色譜圖見圖1，葛根素含量和保留時間見表1。從結(jié)果可知所選不同流動相對葛根素的含量影響差別不明顯，但對保留時間影響很大，確定的流動相為甲醇-0.1%枸櫞酸溶液。

圖1 不同流動相種類對葛根素含量測定對照品和供試品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of different types ofmobile phase on puerarin content determination

表1 不同流動相種類對葛根素含量和保留時間的影響Tab.1 Efffect of different types ofmobile phase on puerarin content and retention time

2.2 流動相配比的影響 采用不同的配比75∶25、50∶50、30∶70、25∶75、20∶80。在流動相為甲醇-0.1%枸櫞酸，流速為1mL／min，波長為250 nm，溫度為30℃的條件下，測定葛根素的含量，其測定的色譜圖見圖2及其計算結(jié)果見表2。由結(jié)果可知流動相的配比對測定葛根素含量有很大的影響，確定流動相配比為25∶75。

圖2 不同流動相配比時對照品和供試品的色譜圖Fig.2 Chromatograms of different ratios ofmobile phase on puerarin content determination

表2 不同流動相配比對葛根素含量和保留時間的影響Tab.2 Effect of different ratios ofmobile phase on puerarin content and retention time

2.3 波長的影響 在190、220、250、280、310 nm不同波長下，流動相為甲醇-0.1%枸櫞酸，流速為1 mL／min，配比為25∶75，溫度在30℃的特定條件下測定葛根素的含量，測定色譜圖結(jié)果見圖3、表3。由結(jié)果可知波長對含量有明顯影響，以250 nm處的吸收光譜為最佳。

圖3 不同波長時的對照品和供試品色譜圖Fig.3 Chromatograms of differentwavelengths on puerarin content determination

表3 不同波長對葛根素含量和保留時間的影響Tab.3 Effect of differentwavelengths on puerarin content and retention time

2.4 流速的影響 在流速分別為0.4 mL／min，0.6 m L／min，0.8 m L／min，1.0 mL／min的條件下，選擇流動相為甲醇-0.1%枸櫞酸，配比為25∶75，溫度為30℃，波長為250 nm的條件下測定葛根素的含量，測定的色譜圖見圖4，計算結(jié)果見表4。由結(jié)果可知，流速對葛根素的含量沒有太大的影響，而對其保留時間影響比較大，選擇流速為1.0mL／min。

圖4 不同流速對葛根素含量測定時對照品和供試品的色譜圖Fig.4 Chromatograms of different flow rate on puerarin content determination

表4 不同流速對葛根素含量和保留時間的影響Tab.4 Effect of different flow rates on puerarin content and retention time

2.5 溫度的影響 選取柱溫25℃、30℃、35℃、40℃，45℃，在流動相為甲醇-0.1%枸櫞酸，流速為1m L／min，波長為250 nm，配比為25∶75的條件下測定葛根素的含量，測定的色譜圖見圖5，計算結(jié)果見表5。由結(jié)果可知溫度對葛根素含量影響并不大，而對其保留時間有影響，溫度越高，保留時間越短，但不能超過色譜柱的最大值，一般應(yīng)低于60℃。

圖5 不同溫度對葛根素含量測定時對照品和供試品的色譜圖Fig.5 Chromatograms of different column temperature on puerarin content determination

表5 不同溫度對葛根素含量和保留時間的影響Tab.5 Effect of different temperatures on puerarin content and retention time

2.6 色譜條件的驗證 由前面實驗確定的測定葛根素含量的色譜條件，更好的了解其重現(xiàn)性對其所選的色譜條件做3次重復(fù)性實驗，結(jié)果見表6。由結(jié)果可知，在所選的色譜條件下測定的葛根素的含量有良好的重復(fù)性，說明所選的條件是可行的。

表6 最佳條件實驗值Tab.6 Experimental value in optimal conditions

3 討論

在選用流動相時，首先考慮溶劑的可操作性，另外流動相對溶劑的要求是分離效果好、黏度低、毒性低、價格低。對于乙腈來說毒性大，因此不是最佳的流動相，對于乙醇來說相對于甲醇黏度大，因此選用甲醇。對于甲醇-水和甲醇-0.1%枸櫞酸，從理論上說最常用的是弱電解質(zhì)的甲醇-水為流動相，但葛根素是弱酸性樣品，因此在流動相中加入少量的弱酸可以調(diào)節(jié)流動相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，并改善峰形。因此所選最佳的流動相為甲醇-0.1%枸櫞酸溶液。

在反相液相色譜中，溶劑的強(qiáng)度隨著極性的增強(qiáng)而減弱，而溶劑的極性與洗脫能力有關(guān)，溶劑的強(qiáng)度越大，極性越弱，洗脫能力越強(qiáng)，保留時間越短。在流動相中隨著甲醇比例的逐漸降低，溶液的極性增強(qiáng)，洗脫能力降低，保留時間最長。一般要求最適宜主峰的保留時間為6～15min，從表2可以看出當(dāng)配比為75∶25和20∶80時，其保留時間相差15.9min；由圖譜可以看出當(dāng)配比為75∶25和50∶50時，其分離效果比較差，且溶劑峰和雜質(zhì)峰比較多；當(dāng)配比為30∶70，25∶75和20∶80時，其測定值對葛根素含量影響不大，但對保留時間影響較大，考慮主峰的保留時間和工作效率，因此最佳的配比為25∶75。

波長過長過短對譜圖影響比較大，溶劑峰干擾比較嚴(yán)重。當(dāng)波長為190 nm和210 nm時其吸收光譜和測定含量的準(zhǔn)確性在相同條件下比其它波長相對來說誤差更大。分析原因，由于所用流動相中甲醇的截止波長為210 nm，截止波長是某一特殊波長具有較強(qiáng)的紫外吸收，當(dāng)作溶劑使用時，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長。當(dāng)小于溶劑截止波長的輻射通過溶劑時，溶劑對此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈的吸收，此時溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測量［15-16］。就是說對于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長，一般選用的檢測波長比溶劑的截止波長長20 nm時，檢測比較準(zhǔn)確。在可見紫外分光光度儀上測得樣品的最大吸收波長為250 nm。綜合考慮可知波長在250 nm處可以靈敏的測定并避開溶劑峰的干擾。

由表4可知，流速越低，保留時間越長，一般來說，當(dāng)主峰保留時間為6～15min比較適合。當(dāng)流速0.4 mL／min為時，其測定葛根素的含量與已知量相差0.6%，可見流速過低，其測定值準(zhǔn)確性較差，且保留時間較長；當(dāng)流速為0.8mL／min和1.0mL／min時，其測定結(jié)果更接近已知含量，但考慮到工作效率，因此選取流速為1.0mL／min比較合適。

在液固和化學(xué)鍵合相色譜中溫度對分離影響并不顯著，在室溫條件下進(jìn)行操作即可，在液相色譜中在流動相中加入緩沖劑以調(diào)節(jié)分配系數(shù)，由于所用的流動相為甲醇-0.1%枸櫞酸，因此溫度對保留值影響較大，考慮環(huán)境條件選用30℃比較適合。

本實驗采用高效液相色譜法測定葛根素的含量，確定最佳的色譜條件：流動相為甲醇-0.1%枸櫞酸，配比為25∶75，波長為250 nm，溫度為30℃，流速為1.0mL／min，此外在此色譜條件下進(jìn)行重演性實驗其重復(fù)性良好，說明其色譜條件是可行的，準(zhǔn)確的，并能快速地測定其含量。

［1］ 中華人民共和國藥典［S?.二部.2002年增補(bǔ)本.

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（編校：吳茜）

Study on chromatographic condition of HPLC method for puerarin content determ ination

LUO Jian-cheng

（College of Biology and Chemistry Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China）

ObjectiveTo study the efficient，sensitive，rapid method for puerarin detection.MethodsHigh performance liquid chromatography was used to study the impactofmobile phase type，ratio，wavelength，flow rate，column temperature and other factors on the determination of puerarin.ResultsChromatographic conditions：mobile phase wasmethanol－0.1%citric acid，ratio was 25∶75，wavelength was 250 nm，flow rate was 1mL／min，column temperature was 30℃.ConclusionThismethod is simple，fast，high sensitivity，the results are accurate for the actual sample analysis.

high performance liquid chromatography；chromatographic condition；content of puerarin

R917

A

1005－1678（2014）09－0160－07

羅建成，男，碩士，副教授，研究方向：生物技術(shù)，E-mail：ny_ explorer＠163.com。