姜黃醇與放療聯(lián)用對人乳腺癌MCF-7細胞的影響研究

王穎，殷詠梅

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南新鄉(xiāng)453100；2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

姜黃醇與放療聯(lián)用對人乳腺癌MCF-7細胞的影響研究

王穎1，殷詠梅2

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南新鄉(xiāng)453100；2.南京醫(yī)科大學(xué)，江蘇南京210029）

目的研究天然中藥提取物姜黃醇（turmeric alcohol）單獨使用或者與放療聯(lián)用對MCF-7人乳腺癌細胞系／MCF-10A正常乳腺上皮細胞的生長抑制效果、腫瘤細胞克隆形成、細胞周期分布和端粒酶活性的影響。方法實驗分4組，分別為：人乳腺癌細胞株MCF-7姜黃醇組；人乳腺癌細胞株MCF-7對照組；正常乳腺上皮細胞MCF-10A姜黃醇組；正常乳腺上皮細胞MCF-10A對照組。2組姜黃醇組分別使用姜黃醇處理，其余2組對照組不作處理。采用細胞增殖檢測方法CCK-8檢測姜黃醇藥物毒性；另外，分別單純給予姜黃醇，或者姜黃醇與放療聯(lián)合，通過集落克隆形成實驗（clone-forming assay）觀察姜黃醇是否影響MCF-7細胞放射敏感性；以流式細胞儀檢測各組乳腺癌細胞的細胞周期分布（細胞處于G1、S、G2的比率）；在機制研究方面，測定腫瘤細胞端粒酶活性、端粒長度在給藥前后的變化。結(jié)果姜黃醇對MCF-7乳腺癌細胞的生長具有顯著的抑制作用，其抑制效果與時間和劑量相關(guān)，并在72h達到平臺期；而采用姜黃醇后正常乳腺上皮細胞MCF-10A的增殖未受到明顯影響?？寺⌒纬赡芰Ψ矫妫?jīng)過姜黃醇處理后即對MCF-7乳腺癌細胞的放射敏感性產(chǎn)生明顯的影響，即合用姜黃醇可顯著降低放療后MCF-7細胞的集落形成率，計算姜黃醇的放射增敏比SERSF2為1.31，SERD0為1.32。而姜黃醇對MCF-10A正常乳腺上皮細胞的細胞周期分布未見明顯影響。結(jié)論姜黃醇可以增加MCF-7人乳腺癌腫瘤細胞的放射敏感性，其放射增敏的機制可能與端粒酶活性下調(diào)、端?？s短以及影響細胞周期分布有關(guān)。同時，姜黃醇對MCF-10A正常乳腺上皮細胞的細胞增殖、放射敏感性和細胞周期分布無明顯影響。姜黃醇可能作為未來臨床上可行的乳腺癌治療放射增敏劑。

放射抗拒；姜黃醇；放射敏感性；乳腺癌

目前腫瘤是全世界范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，雖然腫瘤的治療效果有了很大提高，但在全世界范圍內(nèi)，每年腫瘤的發(fā)病率還在高速增長［1-3］。在中國，無論是發(fā)病率還是死亡率，也在逐年增加，它已成為中國人群發(fā)病率高的疾病之一［4］。作為全世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤，乳腺癌可見于各個年齡層，但主要好發(fā)于中老年婦女。近年來，伴隨生活水平的不斷提高以及營養(yǎng)狀況的改善，乳腺癌在全球的發(fā)病率都有呈逐年升高的趨勢。目前，在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌成為女性死亡的頭號殺手之一，已經(jīng)成為影響女性健康的主要致死性疾病之一［5］。目前針對乳腺癌有很多治療手段，諸如：手術(shù)、化療、放療、生物靶向治療、基因治療等［6］，但由于腫瘤的病因至今尚未明確，因此在現(xiàn)有的認識基礎(chǔ)上，這些療法尚沒有完全令人滿意［7］。本課題在姜黃醇現(xiàn)有的藥理學(xué)研究基礎(chǔ)上，結(jié)合乳腺癌細胞株自身的放射生物學(xué)特點，研究天然中藥提取物姜黃醇（curcumin）單獨使用或者與放療聯(lián)用對MCF-7人乳腺癌細胞系的生長抑制效果、腫瘤細胞克隆形成變化、以及對于細胞周期分布和特異蛋白的影響。根據(jù)所得結(jié)果分析姜黃醇在體外放療增敏作用，其劑量與效應(yīng)關(guān)系、時間與效應(yīng)關(guān)系、效應(yīng)分子變化特征等，以期為乳腺癌的放射增敏研究提供一定的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株：腫瘤細胞MCF-7人乳腺癌細胞株＼MCF-10A正常乳腺上皮細胞由武漢大學(xué)典型物種保藏中心提供，并由本室保存，按細胞培養(yǎng)流程進行常規(guī)細胞培養(yǎng)和傳代。

1.1.2 主要試劑：RNA提取試劑Trizol試劑（Invitroge公司）；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，PCR引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；腫瘤端粒酶活性檢測試劑盒Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA Kit購自Roche公司；DNA回收純化試劑盒（Fermentas公司）、十二烷基磺酸鈉（SDS）（Sigma公司）；瓊脂粉購自日本Agar公司；1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）；特級胎牛血清（杭州四季青公司）；青霉素、鏈霉素（Hyclone公司）；T4DNALigase（Fermentas公司）；膠回收試劑盒（北京天根公司）；腫瘤鼠抗人POT1單克隆抗體，羊抗鼠二抗IgG購自美國的SantaCruz公司；蛋白裂解液（江蘇碧云天公司）；G418（日本Amresco公司產(chǎn)品）；硝酸纖維素膜（晶美公司）；顯影液和定影液（購自柯達）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法 實驗分4組，分別為：腫瘤細胞MCF-7人乳腺癌細胞株姜黃醇組；腫瘤細胞MCF-7人乳腺癌細胞株對照組；MCF-10A正常乳腺上皮細胞姜黃醇組；MCF-10A正常乳腺上皮細胞對照組。2組黃醇組分別使用姜黃醇處理，其余2組對照組不做處理。

1.2.1 腫瘤細胞培養(yǎng)：培養(yǎng)基包含滅活的胎牛血清（10%），100U／mL青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，讓腫瘤貼壁生長。待細胞融合度達90%后進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細胞周期檢測：通過碘化丙啶（propidium，PI）可以與DNA結(jié)合產(chǎn)生熒光強度與DNA含量成正比的原理計算細胞周期的分布情況。以細胞周期檢測試劑盒說明書為基礎(chǔ)進行具體操作。

1.2.3 端粒酶活性的檢測：采用TRAP-PCR-ELISA法檢測細胞前后端粒酶活性的變化。以Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA Kit試劑盒說明書為基礎(chǔ)進行操作。

1.2.4 克隆形成實驗測定腫瘤細胞的放射敏感性：采用腫瘤集落形成法測定腫瘤細胞的克隆形成率，方法如下：收集進入對數(shù)生長期的腫瘤細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA混合液消化后制成單細胞的懸液。將腫瘤細胞制成單細胞懸液，后用細胞計數(shù)儀計數(shù)。單細胞懸液行倍比稀釋成所需的細胞濃度。按照預(yù)定照射劑量的大小，將不同數(shù)目的（102～105個／mL）細胞接種于50mL的塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶放入8mL含胎牛血清的培養(yǎng)液。將消化后的細胞放置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中靜置，時間：4～6 h，讓細胞貼壁生長以備用。按預(yù)定的劑量分別接受0、1、2、3、4、6、8、10 Gy單次劑量照射（射野20 cm×20 cm，SSD＝80 cm，60 Co治療機，以培養(yǎng)瓶細胞貼壁處為劑量參考點），每個劑量點設(shè)3個平行樣本。將上述經(jīng)過照射后的細胞置于專用培養(yǎng)箱中下培養(yǎng)14 d，以利于細胞克隆形成，期間不要挪動培養(yǎng)瓶。去掉培養(yǎng)液，然后用1%甲紫無水乙醇溶液固定和染色20min。用PBS溶液液輕洗2～3次，以去除多余的背景，晾干，將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，在低倍鏡視野下計數(shù)≥50個細胞低克隆數(shù)目。以0Gy細胞組作為對照，計算各個分組的克隆形成率（plating efficiency，PE），其中計算公式為：克隆形成率（PE）＝克隆數(shù)／接種細胞數(shù)×100%。

細胞放射敏感性參數(shù)的計算和存活曲線的擬合：實驗在相同環(huán)境和條件下重復(fù)3次。其中2Gy時的放射增敏比（sensitization enhancementratio，SER）SERSF2定義為2Gy時放射組SF／放射干擾組SF。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件以多靶單擊模型（muti-target single-hitmodel）和線形二次模型（liner-quadratic model）分別擬合實驗數(shù)據(jù)，繪制生存曲線，計算放射生物學(xué)參數(shù)SF2，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 姜黃醇對MCF-7及MCF-10A細胞增殖的影響 如圖1所示，在使用姜黃醇處理后，MCF-7乳腺癌細胞的增殖速度變慢，隨著時間的延長其增殖率不斷下降，在72 h左右達到平臺期。這一結(jié)果表明，姜黃醇對MCF-7乳腺癌細胞株具有明顯的增殖抑制作用，且這種作用在給藥72 h候達到一個平臺期，這為將來姜黃醇用于乳腺癌的治療以及放射增敏所需的時間窗口提供了實驗依據(jù)。

對正常乳腺上皮細胞MCF-10A而言，本研究通過細胞增殖曲線可以觀察到，在使用姜黃醇處理后，MCF-10A細胞的增殖速度未見明顯降低，整體呈現(xiàn)一個平穩(wěn)下降的過程，隨著時間的延長其增殖率不斷下降，但同樣在72 h左右達到持續(xù)的高峰，在72 h以后其增殖率呈現(xiàn)上升的趨勢。這一結(jié)果表明，姜黃醇對正常組織來源的乳腺上皮細胞增殖率的影響較小，且在72 h處理后會進入一個相對平穩(wěn)的平臺期，這一時間區(qū)間與MCF-7乳腺癌細胞的抑制率是一致的。

圖1 姜黃醇處理后MCF-7乳腺癌細胞（A）及MCF-10A正常乳腺上皮細胞（B）的增殖曲線（姜黃醇／對照組）Fig.1 Proliferation curve of breast cancer cells MCF-7（A）and normal breast epithelial cells MCF-10A（B）after turmeric alcohol treatment（turmeric alcohol／control group）

2.2 姜黃醇對MCF-7乳腺癌細胞株及正常乳腺上皮細胞MCF-10A放射敏感性的影響 聯(lián)合應(yīng)用多靶單擊模型和Graphpad 5.0統(tǒng)計繪圖軟件計算MCF-7細胞SF2，D0值，擬合細胞的存活分數(shù)曲線。如圖2所示，MCF-7對照組的D0、SF2分別為2.86，0.596；而腫瘤細胞經(jīng)過姜黃醇處理后，乳腺癌細胞的克隆形成能力明顯下降，D0、SF2分別為2.16，0.456，具體表現(xiàn)為多靶單擊模型的肩區(qū)變窄，存活曲線呈下降的趨勢，計算姜黃醇的放射增敏比分別為SERSF2為1.31，SERD0為1.32。這一結(jié)果表明，腫瘤細胞經(jīng)過姜黃醇處理后，腫瘤細胞對DNA損傷修復(fù)的能力下降，最終表現(xiàn)為對放射線的敏感性增加。而對正常乳腺上皮MCF-10A細胞而言，聯(lián)合應(yīng)用多靶單擊模型和Graphpad 5.0統(tǒng)計繪圖軟件計算SF2，D0值，擬合細胞的存活分數(shù)曲線。如圖2所示，MCF-10A對照組的D0、SF2分別為3.21，0.678；經(jīng)過姜黃醇處理后，乳腺癌細胞的克隆形成能力明顯下降，D0、SF2分別為3.14、0.682，具體表現(xiàn)為多靶單擊模型的肩區(qū)變窄，存活曲線呈下降的趨勢，計算姜黃醇作用后MCF-10A正常上皮細胞的放射增敏比分別為SERSF20.99，SERD01.02。從擬合曲線的形狀來看，姜黃醇作用后細胞存活曲線的肩區(qū)和下降趨勢都未見明顯分離，從放射增敏比的指標(biāo)來看，也未見明顯差異，這一結(jié)果顯示，姜黃醇對正常乳腺上皮來源的MCF-10A的放射敏感性無明顯影響。

圖2 姜黃醇處理后MCF-7乳腺癌細胞（A）及MCF-10A正常乳腺上皮細胞（B）的存活曲線（利用多靶單擊模型擬合）Fig.2 Survival curve of breast cancer cells MCF-7（A）and normal breast epithelial cells MCF-10A（B）after turmeric alcohol treatment（muti-target single-hitmodel）

2.3 姜黃醇對端粒酶活性和端粒長度的影響 如圖3所示，經(jīng)過姜黃醇處理后，乳腺癌細胞的端粒長度和端粒酶活性均下降，提示姜黃醇可以作為一種端粒酶抑制劑作用于乳腺癌細胞，這一結(jié)果與上述的細胞增殖以及放射敏感性的結(jié)果相一致，即端粒長度越長，放射敏感性越低，端粒酶活性越強，放射敏感性越低。

圖3 姜黃醇處理后MCF-7乳腺癌細胞端粒長度及MCF-7乳腺癌細胞端粒酶活性的變化Fig.3 Changes of telomere length and breast telomerase activity of breast cancer cells after turmeric alcohol treatment

2.4 姜黃醇對乳腺癌細胞株細胞周期進程的影響 以未經(jīng)轉(zhuǎn)染的MCF-7作為對照，根據(jù)碘化丙啶的DNA染色原理采用流式細胞儀檢測siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7后24h（MCF-7-siTRF2組）、MCF-7經(jīng)過4Gy X射線照射后24h（MCF-7-R組）以及轉(zhuǎn)染和射線同時作用組（MCF-7-siTRF2-R組）細胞周期分布情況（見表1）。

表1 姜黃醇和照射MCF-7細胞后細胞周期分布Tab.1 Cell cycle distribution of MCF-7 cells after turmeric alcohol and irradiation treatment

與MCF-10A相比，MCF-10A經(jīng)過姜黃醇處理后組G0／G1期細胞比例、S期細胞比例以及G2／M期比例未見明顯統(tǒng)計學(xué)差異；而MCF-7經(jīng)過姜黃醇處理后S期細胞比例降低，G2／M期比例增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這一結(jié)果提示姜黃醇對正常細胞的細胞周期分布未見明顯影響，而對乳腺癌細胞MCF-7而言，使得更多的腫瘤細胞進入對放射線相對敏感的G2／M期，因此MCF-7獲得放射增敏可能與細胞周期的這種再分布有關(guān)。

3 討論

目前研究表明，腫瘤細胞接受2Gy照射后存活分數(shù)（SF2）能夠區(qū)分放射敏感性，并與放療后患者2年存活率、局部控制率、復(fù)發(fā)率等密切相關(guān)［8-10］。體外培養(yǎng)的細胞株其敏感性高低的差別比較大，SF2可變動在0.01～0.90的范圍內(nèi)。SF2值大，表明細胞對射線的敏感性?。籗F2值小，則細胞對射線的敏感性大。本研究中，分別以姜黃醇與MCF-7細胞作用24 h，再分別以不同劑量X射線照射后，相同照射劑量下，實驗組集落數(shù)和細胞存活分數(shù)較空白對照組降低。按照單擊多靶模型擬合細胞存活曲線，提示姜黃醇對人乳腺癌細胞株MCF-7均有明顯的放射增敏作用，其放療增敏比（SERDq）為1.71，姜黃醇作用細胞后的SF2、D0、Dq較單純照射組均明顯降低。姜黃醇作用后Dq值最小，代表腫瘤細胞修復(fù)能力變?nèi)?，意味著腫瘤細胞對放射線的敏感性提高。采用某些藥物或者手段促使腫瘤細胞跨過S期并停留在G2／M期，是在生物學(xué)行為上提高腫瘤細胞對放射敏感性的一個重要途徑［11-13］。本研究中不同濃度姜黃醇作用24 h后，G2／M期細胞比率隨著姜黃醇濃度的增加而增加，而S期細胞比率隨著姜黃醇濃度的增加而下降，此作用存在明顯的劑量依賴性。與對照組相比，單純放療組和藥物＋放療組的G2／M期細胞比例均明顯增多（P＜0.05），而藥物＋放療組的G2／M期細胞比例又明顯高于藥物組和單純放療組（P＜0.05）。說明姜黃醇對MCF-7細胞的周期分布有明顯影響，具有G2／M期阻滯作用。

姜黃醇作為放射增敏劑，在提高乳腺癌細胞放射敏感性方面具有明顯的理論與實踐意義，這一結(jié)果顯示，從中藥制劑中尋找低毒有效的新化合物，可以突破傳統(tǒng)觀點認為的親電子性或乏氧增敏劑的理論范圍［14］。姜黃醇可以降低端粒酶活性、縮短端粒長度、使得腫瘤細胞更多地進入放射敏感的時相，因此姜黃醇是一種潛在的放射增敏藥物。

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（編校：吳茜）

Effect of combination of radiotherapy w ith turmeric alcohol on human breast cancer cell line MCF-7

WANG Ying1，YIN Yong-mei2

（1.Department of Internal Medicine-Oncology，The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University，Henan 453100，China；2.Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China）

ObjectiveTo study the turmeric alcohol of natural herbal extract alone or in combination with radiotherapy on growth inhibitory effect，changes in tumor cell colony formation，cell cycle distribution and the impactof specific proteins of human breast cancer cell line MCF-7.MethodsThere were four groups：human breast cancer cell line MCF-7-turmeric alcohol group；human breast cancer cell line MCF-7-control group；normal breast epithelial cells MCF-10A-turmeric alcohol group；normal breast epithelial cells MCF-10A-control group.Turmeric alcohol toxicity was detected by cell proliferation assay method CCK-8；radiosensitivity ofMCF-7 cellswas observed by clone-forming assay；cell cycle distribution of breast cancer cells（the cells ratio in the G1，S，G2）was detected by flow cytometry in each group；telomerase activity and telomere length changesweremeasured before and after administration.ResultsThe results showed that turmeric alcohol of the growth of MCF-7 breast cancer cells was significantly inhibited，and the inhibitory effectwas time and dose-dependent，and reached a plateau at 72 hours；while the effect of turmeric alcohol on proliferation of normal mammary epithelial cell line MCF-10A was not significantly.Colony-forming ability，radiosensitivity was significantly impacted after turmeric alcohol treatment of breast cancer cell MCF-7 that turmeric alcohol combined with radiosensitivity could significantly reduce the colony formation rate of MCF-7 cells after radiotherapy；sensitivity enhance mentratios of turmeric alcohol were 1.31 of SERSF2，1.32 of SERD0.Conclusion Turmeric alcohol could increase the radiosensitivity of human breast cancer cell line MCF-7，and itsmechanism of radiosensitization may be associated with telomerase activity reducing，telomere shortening and cell cycle distribution.Meanwhile，turmeric alcohol have no obvious influence on normal breast epithelial cell MCF-10A proliferation，radiosensitivity and cell cycle distribution were observed.Turmeric alcoholmay be used as a viable future clinical treatment of breast cancer radiation sensitizer.

radiation resistance；turmeric alcohol；radiosensitivity；breast cancer

王穎，女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：惡性腫瘤的綜合治療，E-mail：122509545＠qq.com。

R285.5

A

1005－1678（2014）08－0073－04

國家自然科學(xué)基金（81172503）