尿素包合法純化東北柞蠶蛹油中不飽和脂肪酸的工藝研究

曲曉宇，張四喜，周利婷，宋燕青

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，吉林長春130021）

尿素包合法純化東北柞蠶蛹油中不飽和脂肪酸的工藝研究

曲曉宇，張四喜，周利婷，宋燕青Δ

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，吉林長春130021）

目的本文對(duì)東北地區(qū)極其豐富的生物資源柞蠶蛹油中不飽和脂肪酸的純化工藝進(jìn)行研究。方法通過超臨界二氧化碳流體萃取法（super critical fluid extraction technology-CO2，SFE-CO2）提取東北柞蠶蛹油，采用尿素包合法對(duì)蠶蛹油混合脂肪酸進(jìn)行純化，并利用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化純化條件。結(jié)果SFE-CO2萃取東北柞蠶蛹干粉中蛹油的萃取率為17.93%（w／w），不飽和脂肪酸油酸、亞油酸和α-亞麻酸占混合脂肪酸含量為22.73%。以脂肪酸-尿素-甲醇（1∶3∶10，w／w／v），包合溫度－10℃，包合時(shí)間為18 h為包合條件，經(jīng)一次包合后，不飽和脂肪酸純度達(dá)到84.08%，二次包合后純度達(dá)95.70%。結(jié)論尿素包合法純化柞蠶蛹油中的不飽和脂肪酸方法操作簡單、成本較低，是進(jìn)一步開發(fā)柞蠶蛹油不飽和脂肪酸產(chǎn)品的可靠純化方法。

尿素包合；東北柞蠶蛹；純化；不飽和脂肪酸；氣相色譜法

柞蠶是我國的優(yōu)勢昆蟲資源，研究表明，柞蠶蛹油中主要含有人體必需的不飽和脂肪酸如油酸、亞油酸及亞麻酸等，具有調(diào)節(jié)血脂、降低血漿總膽固醇、抗血栓形成等藥理作用，國家衛(wèi)生部已將柞蠶蛹列為新的綠色食品源［1］。近年來，日本、韓國等在蠶蛹的開發(fā)利用方面處于領(lǐng)先地位，日本已研究出無蛹臭的食用蛹油［2］。東北地區(qū)是我國傳統(tǒng)的柞蠶主產(chǎn)區(qū)，柞林資源存量豐富，柞蠶生產(chǎn)已成為東北山區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)和民生產(chǎn)業(yè)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，黑龍江、吉林、遼寧和內(nèi)蒙古4?。▍^(qū)）柞蠶繭產(chǎn)量占全國的90%以上，占全世界的80%以上。但是目前東北地區(qū)對(duì)柞蠶蛹的開發(fā)利用則相對(duì)落后，大量柞蠶蛹被作為飼料喂養(yǎng)家禽而未使其高營養(yǎng)價(jià)值得到充分利用［3］。東北柞蠶蛹油經(jīng)皂化后產(chǎn)生混合脂肪酸，因此采用適當(dāng)方法純化不飽和脂肪酸對(duì)開發(fā)柞蠶蛹油保健品至關(guān)重要。本文采用尿素包合法純化東北柞蠶蛹油中的不飽和脂肪酸并利用正交設(shè)計(jì)法考察包合工藝，以提高蛹油中不飽和脂肪酸的含量，為進(jìn)一步開發(fā)東北柞蠶蛹不飽和脂肪酸保健品奠定純化工藝基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)試劑與儀器 81-A-36型培養(yǎng)干燥兩用恒溫箱（吉林農(nóng)安醫(yī)療器械廠）；JS-06S電子計(jì)數(shù)天平（成都普瑞遜電子有限公司）；Spe-ed SFE-2超臨界萃取儀（美國ASI公司）；ETS-D5磁力攪拌器（德國IKA）；RE201-D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮儀器有限公司）；7890-氣象色譜儀（美國安捷倫公司）。

高純CO2（長春巨洋氣體）；氫氧化鈉、氫氧化鉀、無水硫酸鈉、95%乙醇、濃鹽酸、正己烷均為分析純。原料為市售新鮮東北柞蠶蛹。

1.2 東北柞蠶蛹的預(yù)處理 稱取市售新鮮東北柞蠶蛹，置家用搗碎機(jī)中搗碎，將搗碎物置干燥箱中恒溫60℃烘干，得干蠶蛹粉備用。

1.3 柞蠶蛹油的萃取方法 本文采用超臨界CO2流體萃取法提取蛹油。稱量粉碎后的干柞蠶蛹粉50.0 g置于300 mL萃取釜中。分別設(shè)置爐溫（OVEN）和出口閥（VALVE）溫度（80℃），待溫度到達(dá)45℃以后，將萃取釜連接于箱內(nèi)，夾上溫度傳感器。通入二氧化碳，打開排放閥排出萃取釜內(nèi)殘存的少量空氣，關(guān)閉排放閥。打開增壓泵，將萃取壓力調(diào)至50Mpa。打開排放閥開始萃取收集，收集時(shí)間為6 h。放空流速由浮子流量計(jì)測量，放空速度保持在5 L／min左右。萃取結(jié)束后根據(jù)所得柞蠶蛹油的質(zhì)量計(jì)算萃取率μ，μ＝柞蠶蛹油質(zhì)量（g）／干柞蠶蛹粉質(zhì)量（g）×100%。

1.4 柞蠶蛹油混合脂肪酸的制備 稱取25 g柞蠶蛹油置500mL具塞燒瓶中，加入3.7%NaOH乙醇溶液125mL，65℃水浴中攪拌（1000 r／min）1 h，靜置至室溫，加蒸餾水至溶液澄清透明，用鹽酸調(diào)pH 2～3，于分液漏斗中用正己烷100mL萃取，棄水層，水洗油層至中性。油層經(jīng)無水硫酸鈉脫水后于40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無溶劑蒸出，既得混合脂肪酸。平行操作3次，以重量計(jì)混合脂肪酸提取率μ，μ＝總脂肪酸質(zhì)量（g）／柞蠶蛹油質(zhì)量（g）×100%。

1.5 柞蠶蛹油的氣相色譜分析 氣相色譜分析條件為：氣相色譜柱：HP-88型毛細(xì)管柱（100m×0.25mm×0.20μm，安捷倫）。進(jìn)樣口250℃，檢測器260℃，進(jìn)樣量1μL，流量1 mL／min，分流進(jìn)樣，分流比20∶1，F(xiàn)ID檢測器。程序升溫：100℃保持5min，10℃／min到175℃，保持10min，5℃／min到210℃，保持5min，5℃／min到250℃，保持10min。

脂肪酸甲酯化方法：取油2～3滴，加入2mL正己烷，混合均勻，加入1mL 2mol／L KOH-甲醇溶液，混合后，暗處靜置10min，中間取出混合一次，取上層過濾膜進(jìn)樣。

1.6 正交設(shè)計(jì)法考察尿素包合法純化不飽和脂肪酸的工藝 選取脂肪酸-尿素（A）、脂肪酸-甲醇比（B）、包合溫度（C）和包合時(shí)間（D）4個(gè)因素進(jìn)行工藝考察，以不飽和脂肪酸的純度為考察標(biāo)準(zhǔn)，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)L9（34），優(yōu)化尿素包合法分離純化東北柞蠶蛹油中不飽和脂肪酸的最佳工藝條件，正交因素及其水平如下（見表1）。

表1 正交因素水平表Tab.1 Orthogonal table of factors and levels

尿素包合法純化不飽和脂肪酸的具體方法為：按照考察因素脂肪酸-尿素（w／w，A）和脂肪酸-甲醇（w／v，B），先將尿素加入甲醇中，65℃水浴中攪拌使溶解，再加入相應(yīng)比例的脂肪酸，攪拌30 min，冷卻至室溫，設(shè)定包合溫度為C（℃），時(shí)間為D（h）。取出后迅速減壓抽濾，用少量甲醇洗結(jié)晶，濾液用鹽酸調(diào)至pH 2～3，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中用120mL正己烷分3次萃取，棄水層，水洗油層至中性，油層用無水硫酸鈉脫水后，于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無溶劑餾出，即得純化產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 SFE-CO2萃取柞蠶蛹油及混合脂肪酸制備 SFE-CO2萃取法從東北柞蠶蛹干粉中萃取柞蠶蛹油的萃取率為17.93%，RSD%為1.7%（n＝3）。根據(jù)本文1.4項(xiàng)下方法制備混合脂肪酸，以重量計(jì)算收率，柞蠶蛹油混合脂肪酸平均提取率為91.41%，RSD%為1.55%（n＝3）。

2.2 混合脂肪酸的成分分析 根據(jù)本文1.5項(xiàng)下的氣相色譜使用條件及方法，采用面積歸一化法，分析得到東北柞蠶蛹油混合脂肪酸的主要成分及含量為：碳十五烷酸37.03%，棕櫚酸5.63%，碳十七烷酸32.81%，硬脂酸1.79%，油酸3.75%，亞油酸11.98%，α-亞麻酸7%，不飽和脂肪酸的含量占混合脂肪酸比例為22.73%，氣相色譜圖如下（見圖1）。

圖1 柞蠶蛹油混合脂肪酸氣相色譜圖Fig.1 GC chromatogram ofmixed fatty acid

2.3 尿素包合工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果分析，對(duì)脂肪酸純度影響的主次順序?yàn)锽＞C＞D＞A，即脂肪酸-甲醇比影響最大，脂肪酸-尿素比影響最小，正交設(shè)計(jì)結(jié)果如下（見表2）。以不飽和脂肪酸純度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最佳工藝條件確定為A2B3C2D2，即脂肪酸-尿素-甲醇（1∶3∶10），包合溫度－10℃，包合時(shí)間為18 h。采用該條件進(jìn)行純化后，不飽和脂肪酸純度為84.08%，RSD＝1.72%（n＝3）。經(jīng)相同條件進(jìn)行二次包合后，不飽和脂肪酸純度可達(dá)95.70%，RSD＝1.84%（n＝3），二次純化后碳十五烷酸與硬脂酸均已檢測不到，而碳十七烷酸與棕櫚酸含量也明顯下降，純化后氣相色譜圖如下（見圖2）。

表2 純化不飽和脂肪酸正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal test of purifying the unsaturated fatty acids

圖2 柞蠶蛹油純化后脂肪酸混氣相色譜圖Fig.2 GC chromatogram of purified fatty acid

3 討論

我國東北地區(qū)具有極其豐富的柞蠶資源，但目前對(duì)如此巨大的綠色生物資源的開發(fā)利用卻相對(duì)落后而造成浪費(fèi)。因此，亟需采用現(xiàn)代化科技手段對(duì)東北柞蠶蛹的保健功能進(jìn)行開發(fā)，以實(shí)現(xiàn)其潛力巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

柞蠶蛹油中不飽和脂肪酸的純化對(duì)于柞蠶蛹油保健品的開發(fā)至關(guān)重要，目前不飽和脂肪酸的分離方法主要有精餾法、色譜法、尿素包合法、絡(luò)合法等［4-5］。本文采用尿素包合法純化柞蠶蛹油中的不飽和脂肪酸。尿素包合法純化不飽和脂肪酸的原理是當(dāng)尿素溶解于有機(jī)溶劑中，遇脂肪族化合物，尿素分子之間以氫鍵結(jié)合成六面體結(jié)構(gòu)，飽和脂肪酸直徑小于尿素框架的自由空間，在結(jié)晶過程中飽和脂肪酸或單不飽和脂肪酸就能夠進(jìn)入管道內(nèi)，被尿素包合于六面體結(jié)構(gòu)中，形成尿素包合物而析出，而多不飽和脂肪酸由于雙鍵較多而具有一定的空間構(gòu)象，不易被尿素包合，由此采用過濾方法可將飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸分開。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡單，對(duì)設(shè)備要求低。成本較低，所需試劑價(jià)格低廉，且尿素能夠回收重復(fù)利用。而尿素包合法最突出的優(yōu)點(diǎn)是該法不在高溫下進(jìn)行操作，因此能有效地保護(hù)雙鍵，防止氧化［6-7］。

本文對(duì)尿素包合法純化東北柞蠶蛹不飽和脂肪酸的工藝進(jìn)行了考察，確定了純化的最優(yōu)工藝，通過2次包合使不飽和脂肪酸的純度得到了極大的提高，為進(jìn)一步開發(fā)東北柞蠶蛹油產(chǎn)品提供了純化研究基礎(chǔ)。

［1］王茜，王學(xué)英，王卓，等.柞蠶蛹油和不飽和脂肪酸制品的組分分析及對(duì)高血脂癥的防治作用［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2009，35（2）：436-440.

［2］倪紅，陳懷新，楊艷燕.柞蠶蛹綜合利用技術(shù)［J］.湖北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，25（3）：263-266.

［3］封槐松，李建琴.東北柞蠶生產(chǎn)現(xiàn)狀問題與對(duì)策［J］.中國蠶業(yè)，2011（4）：1-5.

［4］張桂梅，何美瑩，姜士寬，等.多不飽和脂肪酸的富集純化方法及研究進(jìn)展［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科技，2008，31（4）：48-53.

［5］徐文暉，王俊儒，梁宗鎖.不飽和脂肪酸分離技術(shù)研究概況［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（8）：153-156.

［6］蔣艷忠.蠶蛹油多不飽和脂肪酸的尿素包合分離研究［J］.食品工業(yè)，2013，34（5）：29-31.

［7］宋燕青，鄧樹海，張四喜，等.蠶蛹油中α-亞麻酸的尿素包合法純化與含量測定［J］.中國生化藥物雜志，2007，28（5）：330-332.

（編校：吳茜）

Investigation on the purification process of unsaturated fatty acid in Northeast tussah pupa oil w ith themethod of urea adduction fractionation

QU Xiao-yu，ZHANG Si-xi，ZHOU Li-ting，SONG Yan-qingΔ

（Department of Pharmacy，The First Hospital of Jilin University，Changchun 130021，China）

ObjectiveTo investigate the purification process of unsaturated fatty acid in Northeast tussah pupa oil with the method of urea adduction fractionation.MethodsThe oil from the Northeast tussah pupa powder was extracted with super critical fluid extraction technology-CO2（SFECO2）.The unsaturated fatty acid was purified with urea adduction fractionation method and the best purification processwas investigated with orthogonal testmethod.The composition of the oilwas detected by gas chromatography（GC）.ResultsThe extracting rate of the oil from the Northeast tussah pupa powderwas 17.93%（w／w），and the percent of unsaturated fatty acid were 22.73%in the mixed fatty acid.The best adduction conditions were obtained：the ration of fatty acid-urea-methanol（1∶3∶10，w／w／v），adduction temperature at－10℃and adduction time at18 hours.The percentof unsaturated fatty acid was 84.08%after first time adduction and 95.70%after second time adduction.Conclusion The method of urea adduction fractionation is compatible with the advantages such as simple operation and low cost.This method is reliable to further develop the products of unsaturated fatty acid from Northeast tussah pupa oil.

urea adduction fractionation；Northeast tussah pupa；purification；unsaturated fatty acid；gas chromatography（GC）

TQ645.1

A

1005－1678（2014）08－0167－03

吉林省中醫(yī)藥管理局科技課題資助項(xiàng)目（3D513M623428）

曲曉宇，男，碩士，藥師，研究方向：藥物制劑學(xué)，E-mail：quxiaoyuhaha＠163.com；宋燕青，通信作者，女，博士，主管藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)，E-mail：59137154＠qq.com。