槲皮素對人前列腺癌PC-3細胞HSP27 m RNA表達和凋亡的影響

于峰，邸彥橙，姜麗麗

（牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院泌尿外科，黑龍江牡丹江157011）

槲皮素對人前列腺癌PC-3細胞HSP27 m RNA表達和凋亡的影響

于峰，邸彥橙，姜麗麗

（牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院泌尿外科，黑龍江牡丹江157011）

目的評價槲皮素對人前列腺癌PC-3細胞熱休克蛋白27（HSP27）mRNA表達和凋亡的影響，初步探討槲皮素抗前列腺癌的可能作用機制。方法體外培養(yǎng)人前列腺癌PC-3細胞株，隨機分為4組：空白對照組；陰性對照組：給予二甲亞砜（DMSO）；高劑量組：給予0.6mg／mL槲皮素150μL；低劑量組：給予0.3mg／mL槲皮素150μL。采用RT-PCR和免疫熒光染色檢測PC-3細胞HSP27 mRNA的表達情況；采用TUNEL檢測給予槲皮素后PC-3細胞凋亡情況。結(jié)果RT-PCR檢測各實驗組PC-3細胞的HSP27 mRNA表達水平分別為128%、110%、50%和60%，2給藥組與空白對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且呈劑量依賴性。免疫熒光染色結(jié)果顯示，槲皮素可明顯降低HSP27陽性細胞染色強度；TUNEL結(jié)果顯示，給藥組可見大量PC-3細胞凋亡，且呈劑量依賴性，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論槲皮素可抑制HSP27 mRNA的表達和誘導(dǎo)PC-3細胞凋亡，這可能是其抗前列腺癌的機制之一。

槲皮素；前列腺癌；熱休克蛋白27；細胞凋亡

熱休克蛋白（HSP）作為分子伴侶廣泛存在于原核與真核細胞內(nèi)，參與細胞凋亡、細胞周期的調(diào)控以及細胞信號傳導(dǎo)等重要的生物學(xué)過程，是生物體內(nèi)具有廣泛和重要生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)［1］。Fuller等［2］研究發(fā)現(xiàn)，HSP和腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、腫瘤免疫，抗腫瘤治療以及腫瘤的預(yù)后等關(guān)系密切。HSP27是HSP亞家族成員之一，在多種腫瘤細胞中均有過表達，其主要的生物學(xué)功能是防止各種應(yīng)激因素對細胞的損傷。另外，HSP27還與調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化及細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)［3］。目前HSP27與腫瘤的關(guān)系日益受到重視，但是有關(guān)HSP27在前列腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中所起的作用仍存在爭議。前列腺癌（prostatic cancer）是歐美地區(qū)男性最常見的惡性腫瘤，近年來在我國的發(fā)病率有逐漸增高趨勢［4］。美國前列腺癌發(fā)病率占男性腫瘤發(fā)病率的第二位，僅次于肺癌［5］。中國前列腺癌發(fā)病率雖然低于歐美國家，但是近年來呈快速增長趨勢。有研究證實，黃酮、多酚類化合物被認為是預(yù)防治療前列腺癌很有潛力的藥物。槲皮素（quereetin）是一種黃酮類化合物，在自然界中廣泛存在，除具有多種生物學(xué)活性，大量體內(nèi)外研究證實，槲皮素具有抗感染、抗氧化、清除氧自由基和抗腫瘤等多種作用外［6］，還可通過多種機制抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡等，發(fā)揮抗腫瘤活性［7］，在臨床上是非常有應(yīng)用價值和前景的抗腫瘤藥物。本研究旨在評價槲皮素對人前列腺癌PC-3細胞HSP27mRNA表達和凋亡的影響，初步探討槲皮素抗前列腺癌的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物 槲皮素購自Sigma公司，純度98%。使用二甲亞砜（DMSO）分別配制成0.3mg／mL（半數(shù)有效量［8］）和0.6mg／mL溶液，－20℃冰箱保存，備用。

1.2 細胞株 人前列腺癌PC-3細胞株購自上海艾研生物科技有限公司，分為4組：空白對照組；陰性對照組：DMSO；槲皮素高劑量組：給予0.6mg／mL槲皮素150μL；槲皮素低劑量組：給予0.3mg／mL槲皮素150μL。

1.3 細胞培養(yǎng)與給藥 PC-3細胞株保存在含有10%胎牛血清的F12營養(yǎng)培養(yǎng)基（含青霉素100 U／mL和鏈霉素100μg／mL）。按照細胞密度1×106個／孔接種于6孔板中，37℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)24 h后分為4組：空白對照組，陰性對照組，槲皮素高劑量組，槲皮素低劑量組。待80%細胞融合后，更換新鮮培養(yǎng)液，分別加入0.6、0.3mg／mL槲皮素150μL，空白對照組不給藥，陰性對照組給予等體積DMSO。收集培養(yǎng)液用于后續(xù)分析。

1.4 RT-PCR檢測PC-3細胞HSP27mRNA的表達 按照說明書，TRIzol試劑盒抽提總RNA，溶于20μL DEPC-H2O，依次加入2.5μL DNA酶，2.5μL 10×buffer，37℃水浴30min后，65℃水浴10min，分光光度法檢測RNA濃度。HSP27 PCR引物是：5′-AAGGAAATTCAAAATGCTGTCAA-3′（正向）和5′-ACAGACAAGATCTCCCGGCACTT-3′（反向），GAPDH擴增產(chǎn)物：5′-GGTCAACGGGTAGGTGTTTG-3′（正向）和5′-GCCTTTGGGCTCTGCATGAA-3′（反向）。HSP27 PCR反應(yīng)總體積25μL。使用GeneAmp 2400熱循環(huán)儀，預(yù)變性94℃5min，變性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳（110V，35mA，30min），溴化乙錠染色，BandScan 5.0軟件進行電泳結(jié)果吸光度積分值分析，HSP27 mRNA表達相對含量值（灰度比）＝HSP27吸光度積分值／GAPDH吸光度積分值。

1.5 PC-3細胞免疫熒光染色 常規(guī)方法收獲細胞，胰蛋白酶消化貼壁細胞，PBS沖洗后，TCM-N3沖洗，50mL錐形管2000 r／min離心10min。將上清液吸出并重新懸浮于1mL TCM-N3，滴于載玻片（多聚賴氨酸包被）上吹干，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗滌5min，共5次。滴加5 g／L BSA封閉液，37℃封閉30min，加入相應(yīng)的一抗兔抗小鼠HMGBl抗體（1∶200），PBS洗滌5min，共5次。加入熒光標記的二抗PE標記的驢抗兔IgG（1∶500），避光，37℃孵育2 h，PBS洗滌5min，共5次。Hoechst 33342染料避光37℃孵育15min，PBS洗滌，共3次。緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察、拍照并保存。

1.6 TUNEL檢測PC-3細胞凋亡 使用TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒檢測槲皮素對PC-3細胞凋亡的影響。將細胞用PBS沖洗，－20℃甲醇固定15min，然后PBS沖洗細胞3次，加入50μL TUNEL反應(yīng)液，避光37℃孵育1 h。PBS沖洗細胞，Hoechst33258染料37℃染色10min。凋亡指數(shù)＝TUNEL陽性細胞數(shù)／細胞總數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)計量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)采用單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對PC-3細胞HSP27 mRNA表達的影響 RTPCR檢測結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組PC-3細胞的HSP27 mRNA表達水平明顯升高，分別為128%和110%；給予槲皮素干預(yù)后，PC-3細胞的HSP27 mRNA表達水平明顯降低，分別為50%和60%，并且槲皮素高劑量組降低更加明顯，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖1）。

圖1 槲皮素對PC-3細胞HSP27 mRNA表達的影響*P＜0.05，與對照組相比Fig.1 Effect of quereetin on the HSP27 mRNA expression*P＜0.05，compared with the control group

2.2 PC-3細胞免疫熒光染色結(jié)果 免疫熒光染色結(jié)果顯示，空白對照組和陰性對照組HSP27陽性細胞染色強度明顯高于槲皮素治療組，并且槲皮素高劑量組HSP27陽性細胞染色強度降低更加明顯（見圖2）。

圖2 PC-3細胞免疫熒光染色結(jié)果（×400）Fig.2 Immunofluorescent staining results of PC-3 cell（×400）

2.3 槲皮素對PC-3細胞凋亡的影響 槲皮素高劑量組和低劑量組可見大量凋亡PC-3細胞，且高劑量組高于低劑量組，呈劑量依賴性，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖3）。

圖3 槲皮素誘導(dǎo)PC-3細胞凋亡（SP，×200）*P＜0.05，與對照組相比Fig.3 PC-3 cell apoptosis induced by quereetin（SP，×200）*P＜0.05，compared with control group

3 討論

HSP是應(yīng)激條件下產(chǎn)生的高度保守的分子伴侶［9］，是組織和器官受到刺激或應(yīng)激時表達的主要蛋白質(zhì)，可參與細胞損傷、防御、修護產(chǎn)生而控制細胞功能［10］。HSP27作為小HSP亞家族中的重要一員，近年來研究HSP27與腫瘤的關(guān)系成為熱點。正常組織細胞內(nèi)HSP27的表達水平很低。應(yīng)激狀態(tài)可致胞內(nèi)HSP27磷酸化并致其寡聚體解聚，HSP27表達上調(diào)，參與腫瘤的發(fā)生、侵襲以及轉(zhuǎn)移過程［11］。本研究結(jié)果顯示空白對照組和陰性對照組HSP27陽性細胞染色強度明顯增高。研究結(jié)果與其相一致。

槲皮素是一種具有多種生物活性且無明顯毒副作用的黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜及水果中，具有抗腫瘤、抗氧化、清除氧自由基、抗感染、抗血栓和抗病毒等多種活性，特別是抗腫瘤作用逐漸被人們所認識并引起廣泛的重視［4，12］。然而槲皮素對前列腺癌的作用知之甚少。故此，本研究旨在討論槲皮素對PC-3細胞HSP27 mRNA表達和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，槲皮素可以抑制HSP27mRNA的表達，而且隨著劑量增加，抑制作用增強，具有劑量依賴性。另外還發(fā)現(xiàn)，槲皮素對PC-3細胞增殖具有顯著抑制作用。槲皮素抑制PC-3細胞HSP27mRNA的表達和誘導(dǎo)PC-3細胞凋亡可能是其抗前列腺癌的機制之一。

綜上所述，PC-3細胞HSP27mRNA表達水平明顯增高，而槲皮素可以抑制PC-3細胞HSP27mRNA表達，高濃度的槲皮素抑制作用更強，為尋找治療治療靶位奠定了基礎(chǔ)。同時，槲皮素還誘導(dǎo)PC-3細胞凋亡，然而槲皮素誘導(dǎo)PC-3細胞凋亡的具體作用機制有待深入研究。

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［3］Roeehi P，So A，Kojima S，et a1.Heat shock protein 27 inereases after androgen ablation and plays a cytoproteetive role in hormone refractory prostate cancer［J］.Cancer Res，2004，64（18）：6595-6602.

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［5］何毅，張齊梅，章卓.槲皮素對人前列腺PC3細胞株增殖和凋亡影響［J］.瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2013，36（4）：340-342.

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（編校：譚玲）（編校：吳茜，劉路路）

Effect of quereetin on the expression of HSP27 mRNA and apoptosis of human prostate cancer PC-3 cell

YU Feng，DIYan-cheng，JIANG Li-li

（Department of Urinary Surgery，Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China）

ObjectiveTo evaluate the effectof quereetin on the expression of HSP27 mRNA and apoptosis of human prostate cancer PC-3 cell and discuss themechanism of quereetin on prostate cancer.MethodsHuman prostate cancer PC-3 cells were cultured and randomly divided into four groups：blank control group，negative control group（dimethylsulfoxide，DMSO group），high dose group（0.6 mg／mL quercetin 150μL），low dose group（0.3mg／mL quercetin 150μL）.RT-PCR and immunofluorescence staining were performed to detect the HSP27 mRNA expression，and the TUNEL staining was used to analyse the PC-3 cell apoptosis after quercetin treatment.ResultsRT-PCR results showed HSP27 mRNA expression was respectively 128%，110%，50%and 60%in four groups and displayed dose dependent manner.The difference between blank control group and quercetin treatment groups was statistically significant（P＜0.05）.Immunofluorescence staining showed quercetin could decrease the intensity of HSP27.TUNEL staining displayed large amountof apoptotic cells in quercetin treatment groups and showed dose dependentmanner.Compared with the blank control group，the differencewas statistically significant（P＜0.05）.Conclusion Quercetin could inhibit PC-3 cell HSP27 expression and induce cell apoptosis，such effectsmay be onemechanism of its anti-prostate cancer.

quereetin；prostate cancer；heat shock protein 27；cell apoptosis

R585.5

A

1005－1678（2014）08－0047－03

于峰，男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：泌尿外科疾病的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：yufeng80＠126.com。