雌二醇對成骨細胞OPG和RANKL的影響

龔 沂

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江西 南昌 330006)

骨質(zhì)疏松是目前老年常見的骨代謝性疾病，隨著社會老齡化其發(fā)病越來越多且以絕經(jīng)后婦女為主。大量的基礎(chǔ)研究已肯定了雌激素的保護作用，但其作用機制仍不明〔1〕。近年來隨著護骨素(OPG)的發(fā)現(xiàn)，對OPG/細胞核因子-κB受體活化因子(RANK)/細胞核因子-КB受體活化因子配體(RANKL)系統(tǒng)的研究受到關(guān)注，這些細胞因子在調(diào)節(jié)破骨細胞的形成和活化方面起著關(guān)鍵的作用，是諸多骨代謝調(diào)節(jié)激素或因子在細胞水平發(fā)揮作用的共同通道〔2，3〕。本實驗通過觀察17β雌二醇(17β-E2)對成骨細胞(OB)分泌的OPG、RANKL表達的影響，旨在探討雌激素治療骨質(zhì)疏松的機制。

1 材料和方法

1.1材料 MEM培養(yǎng)基干粉購自GIBCO BRL公司；小牛血清、胎牛血清購自NBS GIBCO BRL公司；17β-E2、Ⅱ型膠原酶、核酸分子量標準購自Sigma公司；大鼠白血病病毒(MMLV)第一鏈cDNA合成試劑盒、即用PCR擴增試劑盒購自上海生物工程技術(shù)公司；OPG、RANKL引物由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 酶消化法分離培養(yǎng)24 h內(nèi)新生SD大鼠(來自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗科學(xué)部)顱蓋骨OB，通過堿性磷酸酶染色、礦化結(jié)節(jié)染色對成骨細胞進行鑒定。

1.2.2干預(yù)試驗 傳代時將細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，匯合后加入即配的藥物干預(yù)，分為對照組、10-10mol/L組、10-9mol/L組、10-8mol/L組、10-7mol/L 17β-E2組。細胞生長匯合后，抽提總RNA。

1.2.3RT-PCR檢測 Trizol抽提總RNA，MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA，PCR擴增OPG、RANKL基因，GAPDH為內(nèi)對照。OPG正義：5′-TGC TTT CGA TGA CGT CTC AC-3′，反義5′-CAC TGC ACA GTC AGG AGG AA-3′，擴增長度為318 bp；RANKL正義：5′-GCG CTC GAA AGT ACA GGA AC-3′，反義：5′-AGC CGA GAC TAC GGC AAG TA-3′，擴增長度為208 bp。OPG反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，52℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)，最后延伸5 min。RANKL反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火60 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)，最后延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物于1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行條帶光密度定量檢測。

2 結(jié) 果

2.1OB鑒定 原代OB培養(yǎng)3 d后呈多角形、梭形，12～15 d呈細胞單層貼壁，傳代細胞胞核較大，細胞質(zhì)內(nèi)見黑色顆粒，細胞形態(tài)為多角形或梭形，見突起，見圖1；三代細胞堿性磷酸酶染色陽性，胞質(zhì)見大量灰黑色顆粒，細胞鑒定符合成骨細胞特征，見圖2。

圖1 成骨細胞呈梭形或三角形

圖2 成骨細胞堿性磷酸酶染色(×100)

2.2不同濃度17β-E2對OB OPG和RANKL mRNA的影響 見表1，圖3。本實驗中RT-PCR半定量結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度(10-9、10-8、10-7mol/L)的17β-E2對OB OPG mRNA表達具有顯著的增強作用(P<0.05)，其中10-8mol/L 17β-E2對OB OPG mRNA表達最高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而10-10mol/L 17β-E2對OB OPG mRNA表達幾乎無影響，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，10-10、10-9、10-7mol/L 17β-E2對OB細胞RANKL mRNA表達幾乎無影響，與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其中10-8mol/L 17β-E2對OB RANKL mRNA的表達具有明顯的抑制作用，其RANKL mRNA表達與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 不同濃度17β-E2對OB OPG、RANKL mRNA表達的影響

1：核酸分子量標志物；2：對照組；3：10-10 mol/L 17β-E2組；4：10-9 mol/L 17β-E2組；5：10-8 mol/L 17β-E2組；6：10-7 mol/L 17β-E2組

3 討 論

OPG于1997年首次發(fā)現(xiàn)，近年來受到較多關(guān)注。OPG通過與RANKL結(jié)合，而阻斷其與RANK受體結(jié)合。當RANKL與OPG結(jié)合時，抑制破骨細胞前體分化和成熟破骨細胞形成骨陷窩，并誘導(dǎo)破骨細胞凋亡〔4〕。研究顯示，OPG+/+鼠表現(xiàn)為大理石樣骨硬化病，其硬化程度與OPG mRNA水平呈正相關(guān)。OPG-/-鼠則表現(xiàn)出嚴重骨質(zhì)疏松和動脈鈣化。RANKL一旦與RANK結(jié)合，可激活細胞核因子-κB和c-Jun氨基端激酶，刺激前體破骨細胞分化、增殖與融合，活化成熟破骨細胞，抑制其凋亡〔5，6〕。當它與巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)同時存在時，不需要OB、骨髓基質(zhì)細胞和其他任何因子可劑量依賴式地增加破骨細胞的形成和融合〔7〕，促進破骨細胞骨吸收。有研究證實，雌激素可通過增加去卵巢鼠股骨中的OPG和RANKL的表達，抑制破骨性骨吸收，對去卵巢鼠的骨質(zhì)疏松有明顯的治療作用〔8〕。

本研究結(jié)果提示了不同濃度17β-E2促OB OPG表達。另一方面，17β-E2抑制OB RANKL表達，與文獻報道結(jié)果相一致〔9〕。因此，雌激素可促進OPG的表達，抑制RANKL表達，從而使OPG/RANKL比例上調(diào)，發(fā)揮雌激素的骨保護作用。

4 參考文獻

1陳 娟，謝麗華，李生強，等.絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥腎陰虛證關(guān)聯(lián)基因 CLCF1 mRNA 的表達研究〔J〕.中國骨質(zhì)疏松雜志，2014;20(6)： 618-22.

2王 怡，劉 偉，趙鴻雁，等.鎘對大鼠成骨細胞OPG/RANKL表達的影響〔J〕.揚州大學(xué)學(xué)報：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2014;35(1)： 9-12.

3張永芝，扈英偉，徐 欣.1α，25(OH)2D3對不同分化階段成骨細胞RANKL及OPG基因表達的影響〔J〕.中國骨質(zhì)疏松雜志，2014;20(4)：382-6，403.

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7熊 茜，張秀珍.17β-雌二醇對新生大鼠成骨細胞護骨素和破骨細胞分化因子表達的調(diào)節(jié)〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2007;23(3):224-5.

8Su SJ，Yeh YT，Shyu HW.The preventive effect of biochanin a on bone loss in ovariectomized rats: involvement in regulation of growth and activity of osteoblasts and osteoclasts〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med，2013;2013:594857.

9喬 珍，綦才輝，楊關(guān)子，等.促黑素對小鼠成骨細胞 OPG /RANKL mRNA 表達的影響〔J〕.山東大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2014;52(3)：56-8，63.